Nội dung
CRISPR/Cas9 là gì?
Hệ thống CRISPR hiện diện tự nhiên ở hầu hết vi khuẩn cổ và vi khuẩn để bảo vệ chúng khỏi sự xâm nhập của virus và plasmid.
Hoạt động của hệ thống CRISPR liên quan đến sự phân cắt ADN sợi đôi ngoại lai được hướng dẫn bằng ARN, sau đó được sửa chữa thông qua con đường nối đầu không tương đồng không chính xác (NHEJ) hoặc con đường sửa chữa theo hướng tương đồng phụ thuộc vào khuôn mẫu (HDR).
So với các kỹ thuật chỉnh sửa gen khác như nuclease ngón tay kẽm (ZFN) và nuclease tác động giống chất kích hoạt phiên mã (TALEN), CRISPR/Cas9 là một công cụ chỉnh sửa bộ gen đa kênh, chính xác, đáng tin cậy, mạnh mẽ và hiệu quả về mặt chi phí.
Các bước thực hiện CRISPR-Cas
Một mảng CRISPR thường được tìm thấy trong hầu hết các bộ gen của vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Mảng này chứa nhiều trình tự protospacer độc đáo có tính tương đồng với ADN ngoại lai cụ thể. Các protospacers này có các chuỗi lặp lại palindromic ngắn giữa chúng. Dưới đây là tổng quan về hệ thống CRISPR/Cas9, hệ thống CRISPR vi khuẩn nội sinh loại II.
- Sau khi thu được miếng đệm từ ADN xâm lấn, mảng CRISPR được phiên mã thành ARN tiền CRISPR (tiền crRNA).
- crRNA kích hoạt chuyển hóa (tracrRNA), bổ sung cho pre-crRNA tạo thành một chuỗi song công RNA với pre-crRNA. Trong song công RNA, pre-crRNA trưởng thành để tạo thành crRNA bằng cách tuyển dụng RNAse III. RNA song công chứa crRNA với tracrRNA còn được gọi là RNA hướng dẫn đơn (sgRNA).
- Các phức hợp sgRNA với endnuclease Cas9 để tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hỗ trợ đánh chặn mục tiêu.
- Phức hợp ribonucleoprotein tiến hành tìm kiếm và nhận dạng mục tiêu dựa trên sự ghép cặp bazơ bổ sung của crRNA với protospacer trong DNA mục tiêu liền kề với mô-đun liền kề protospacer (PAM).
- Khi liên kết phức hợp ribonucleoprotein với DNA mục tiêu, Cas9 tạo điều kiện cho việc tháo xoắn chuỗi xoắn kép DNA tại vị trí đích và cắt DNA chuỗi kép ở 3 cặp bazơ ngược dòng vùng PAM của nó.
- Sau khi phân tách DNA sợi đôi, phức hợp ribonucleoprotein sẽ tách ra.
Ứng dụng của công nghệ CRISPR/Cas9
Chỉnh sửa bộ gen bằng hệ thống CRISPR/Cas9 liên quan đến việc phân tách ADN mục tiêu sợi đôi bằng cách sử dụng endnuclease Cas9 được hướng dẫn bởi ARN. Các chuỗi ADN bị cắt được sửa chữa thông qua con đường HDR hoặc NHEJ.
Điều này ngụ ý rằng Cas9 và các chuỗi sgRNA có thể được thay đổi theo nhiều cách khác nhau để cải thiện tính đặc hiệu và hiệu quả của hệ thống CRISPR/Cas9 và do đó nâng cao tiềm năng của nó cho một số ứng dụng.
Hệ thống CRISPR/Cas9 có thể được sử dụng để thu được các đột biến điểm, chèn, xóa và đảo ngược trình tự để sửa đổi locus di truyền.
Những phát triển gần đây trong công nghệ CRISPR cho phép sử dụng nó để điều chỉnh và thẩm vấn bộ gen một cách chính xác.
Đồng thời, nó tìm thấy ứng dụng như một công cụ hình ảnh để theo dõi vị trí gen trong thời gian thực.
Do đó, phạm vi ghép kênh của kỹ thuật CRISPR/Cas9 đã giúp các nhà khoa học có thể liên hệ hệ thống này để sửa đổi bộ gen ở nhiều loại sinh vật.
Hệ thống CRISPR/Cas9 là một công nghệ mạnh mẽ tìm ra các ứng dụng sinh học đa dạng và sáng tạo.
CRISPR/Cas9 có một số lợi thế so với các công cụ chỉnh sửa gen khác. Ví dụ, hệ thống CRISPR/Cas9 có thể nhắm mục tiêu vào nhiều vị trí trên ADN sợi đôi hơn TALEN và ZFN, và endnuclease Cas9 có một số biến thể có nhiều ứng dụng.
Hơn nữa, việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 dễ dàng có nghĩa là nó có thể được thực hiện ở hầu hết mọi phòng thí nghiệm.
Các công cụ dựa trên Cas9 đã cải thiện đáng kể khả năng của chúng tôi trong việc tiến hành phân tích có hệ thống về chức năng gen và tái tạo chính xác hơn sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể liên quan đến khối u.
Công nghệ này cũng đã tạo ra con đường phía trước cho di truyền học biểu sinh, việc mổ xẻ các chức năng gen dư thừa và các liệu pháp gen tiềm năng.
Phân loại hệ thống CRISPR và vai trò của Cas9
Vì có rất nhiều protein Cas, locus CRISPR đa dạng, cũng như tiềm năng cho các sự kiện chuyển giao theo chiều ngang, nên việc phân loại hệ thống CRISPR-Cas là một nhiệm vụ khá phức tạp. Phân loại được sử dụng phổ biến nhất để phân biệt ba loại hệ thống CRISPR-Cas, mỗi loại có một số nhóm con. Một đề xuất gần đây thuộc loại thứ tư vẫn còn gây tranh cãi trong cộng đồng khoa học.
Hệ thống loại 1 được xác định bởi sự xuất hiện của protein đặc trưng Cas3, chứa cả hai miền DNAase và helicase được sử dụng để phân hủy mục tiêu. Sáu loại phụ của hệ thống này đã được xác định, và ngoài các gen cas1 , cas2 và cas3 , tất cả chúng đều mã hóa một phức hợp giống Cascade liên kết với crRNA và xác định chính xác mục tiêu.
Hệ thống loại 2 hơi độc đáo so với các hệ thống CRISPR-Cas khác, vì thực tế chỉ cần một protein Cas để làm im lặng gen – đây là protein Cas9. Nó tham gia vào quá trình xử lý crRNA nhưng cũng chịu trách nhiệm phá hủy DNA mục tiêu. Sự đơn giản của hệ thống này khiến nó phù hợp với việc chuyển đổi để chỉnh sửa bộ gen, đây là một lĩnh vực đang phát triển nhanh chóng, thu hút các nhà nghiên cứu y sinh trên khắp thế giới.
Hệ thống loại 3 được xác định bởi sự xuất hiện của protein đặc trưng Cas10, chức năng của nó vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng. Tính đặc hiệu của hệ thống CRISPR-Cas này có khả năng nhắm mục tiêu vào cả DNA và RNA (trong khi hệ thống loại 1 và 2 chỉ nhắm mục tiêu vào DNA). Cùng với hệ thống loại 1, nó có thể được tìm thấy ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ (so với hệ thống loại 2 chỉ được tìm thấy ở vi khuẩn).
Tất cả các hệ thống CRISPR-Cas nói trên đều được coi là các yếu tố di truyền di động biểu hiện sự chuyển giao theo chiều ngang thường xuyên, điều này giải thích mức độ phổ biến cao của chúng trong thế giới nhân sơ. Mức độ biến đổi của chúng có thể được sử dụng như một dấu hiệu đánh dấu sự đa dạng và tiến hóa của một số loài nhất định, đồng thời nó cũng có thể được coi là hồ sơ di truyền của các sự kiện “tiêm chủng” (phản ánh những thay đổi trong điều kiện môi trường theo thời gian).
Tương lai của CRISPR/Cas9
Tiến bộ nhanh chóng trong việc phát triển Cas9 thành một bộ công cụ dành cho nghiên cứu sinh học tế bào và phân tử là rất đáng chú ý, có thể là do tính đơn giản, hiệu quả cao và tính linh hoạt của hệ thống.
Trong số các hệ thống nuclease thiết kế hiện có sẵn cho kỹ thuật gen chính xác, hệ thống CRISPR/Cas cho đến nay là hệ thống thân thiện với người dùng nhất.
Giờ đây cũng rõ ràng rằng tiềm năng của Cas9 vượt xa sự phân tách ADN và tính hữu ích của nó trong việc tuyển dụng các protein dành riêng cho từng vị trí bộ gen có thể sẽ chỉ bị giới hạn bởi trí tưởng tượng của chúng ta.
Tài liệu tham khảo
- https://international.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology
- http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4025954/
- http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300908415001042
