Oligonucleotide là gì?

Oligonucleotide (hoặc oligos) có nhiều ứng dụng từ nghiên cứu đến chẩn đoán bệnh và gần đây là phương pháp điều trị. Sự sẵn có rộng rãi của ADN và ARN chuỗi đơn tổng hợp rẻ tiền đã mở đường cho việc khuếch đại ADN thông thường bằng PCR.

Việc sử dụng oligonucleotide làm mồi này đã cách mạng hóa việc nghiên cứu biểu hiện gen và quá trình gây bệnh. Ngày càng có nhiều công nghệ dựa trên mồi để xác định đặc tính, theo dõi và đo lường mọi thứ liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến axit nucleic. Ngoài việc sử dụng làm mồi PCR, oligonucleotide còn được sử dụng làm mẫu dò, trong microarray, lai tại chỗ, phân tích antisense và thậm chí làm chất mang thuốc.

Các loại oligonucleotide

Oligonucleotide là các polyme chuỗi đơn ngắn của axit nucleic.

Oligos có thể không được biến đổi hoặc được biến đổi bằng nhiều loại hóa chất tùy thuộc vào mục đích sử dụng của chúng, ví dụ, việc bổ sung các nhóm photphat 5′ hoặc 3′ để cho phép nối hoặc mở rộng khối tương ứng, dán nhãn bằng các hạt nhân phóng xạ hoặc chất fluorophores và/hoặc chất khử để sử dụng làm chất thăm dò, sự kết hợp của thiol, amino hoặc các gốc phản ứng khác để cho phép liên kết cộng hóa trị của các phân tử chức năng như enzyme và mở rộng với các trình liên kết và đoạn đệm khác có chức năng đa dạng.

Oligo ADN được sử dụng phổ biến nhất, nhưng oligo ARN cũng có sẵn.

Độ dài của một oligo thường được xác định bằng cách thêm hậu tố -mer.

Ví dụ, một oligonucleotide có 19 nucleotide (bazơ) được gọi là 19-mer.

Đối với hầu hết các mục đích sử dụng, oligonucleotide được thiết kế để ghép cặp bazơ với một chuỗi ADN hoặc ARN.

Đoạn mồi cho PCR

Việc sử dụng phổ biến nhất của oligonucleotide là làm mồi cho PCR (phản ứng chuỗi polymerase). Các đoạn mồi được thiết kế có ít nhất một phần trình tự bổ sung cho đầu 5′ của trình tự nhằm mục đích khuếch đại.

Các đặc điểm sau đây cần thiết cho mồi PCR hiệu quả:

• Độ dài tối ưu cho trình tự bổ sung là 18–22 nucleotide.
• Các mồi ghép đôi phải có nhiệt độ nóng chảy tương tự (Tm).
• Thành phần tối ưu là 40–60% GC với kẹp GC (một cặp bazơ G hoặc C) trong 5 bazơ cuối cùng của đầu 3′ và không quá 3 G hoặc C trong 5 bazơ cuối cùng ở đầu 5′ kết thúc.
• Nên tránh các trình tự lặp lại dài chỉ chứa 1 loại bazơ duy nhất.
• Ít hoặc không có cấu trúc bậc 2 như “hairpin”.
• Không xảy ra “self-dimers”; mồi không nên tương đồng với chính nó.
• Không xảy ra “cross dimers”; cặp mồi không nên dime hóa.

Trình tự mồi tối ưu cho PCR thường được xác định bằng phần mềm thiết kế mồi. Đối với một số mục tiêu, không dễ để tìm được cặp mồi đáp ứng các tiêu chí trên ngay cả khi có sự trợ giúp của thiết kế phần mềm.

Có một số thiết kế mồi với các thành phần hóa học phát hiện dựa trên mồi và đầu dò khác nhau để phát hiện huỳnh quang của khuếch đại mục tiêu.

Hầu hết các đầu dò huỳnh quang đều sử dụng phương pháp dập tắt huỳnh quang, trong đó chất phóng huỳnh quang bị dập tắt bởi chất khử ở gần cho đến khi mồi lai với một chuỗi axit nucleic.

Tùy thuộc vào thiết kế đầu dò, khi mồi liên kết với trình tự bổ sung của nó, khoảng cách giữa chất dẫn và chất khử sẽ tăng lên hoặc chất phóng thích bị tách ra khỏi mồi. Sau đó, phức hợp có thể phát huỳnh quang. Đầu dò huỳnh quang có thể được sử dụng để định lượng chính xác biểu hiện gen bằng PCR thời gian thực hoặc PCR kỹ thuật số.

Các xét nghiệm PCR và panel cho các gen liên quan đến quá trình sinh học

Trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, các xét nghiệm PCR và panel đã được thiết kế để phát hiện và đo lường sự biểu hiện của các gen có liên quan đến sinh học.

Các đĩa xét nghiệm được cấu hình sẵn sẵn có cho phạm vi ngày càng tăng của các con đường chính tắc, bệnh tật, tín hiệu và các quá trình tế bào khác, với các ví dụ bao gồm con đường truyền tín hiệu IL-12, gen chuyển hóa glycogen và các nhóm protein như yếu tố tăng trưởng (growth factor).

Các xét nghiệm PrimePCR™ đã được xác nhận bởi phòng thí nghiệm Bio-Rad (hiện chỉ có ở Hoa Kỳ và Canada) bao gồm các panel xét nghiệm được cấu hình sẵn bao gồm các lộ trình tương tác phức tạp có thể tiết lộ các mô hình điều hòa và tương tác gen liên quan đến sinh học, cung cấp một bức tranh toàn diện về tín hiệu, trao đổi chất và bệnh tật quá trình.

Những panel này được thiết kế để đo lường những thay đổi trong biểu hiện của nhiều gen cùng một lúc.

Những oligonucleotide này được thiết kế sao cho các bộ khuếch đại PCR (PCR amplicon):

Tránh các vùng có chứa SNP.

Mở rộng các intron nếu có thể.

Phát hiện số lượng biến thể phiên âm tối đa.

Tránh các khu vực tương đồng chéo với các mục tiêu khác.

Ứng dụng Oligonucleotide trong giải trình tự

Trình tự hiện đại sử dụng công nghệ cơ bản giống như PCR, với sự liên kết của mồi với chuỗi ADN đơn, sau đó là phần mở rộng, mặc dù các nền tảng khác nhau sử dụng các công nghệ khác nhau để đọc trình tự kết quả của các bazơ.

Bất cứ khi nào có thể, các loại mồi phổ quát sẽ được sử dụng thay vì các loại mồi dành riêng cho mục tiêu cụ thể.

Các đoạn mồi phổ biến với các trình tự bổ sung cho các trình tự ở cạnh vị trí nhân bản đa dòng (MCS) của plasmid mang có thể được sử dụng để sắp xếp trình tự ADN đã được nhân bản thành các plasmid thông thường.

Trong giải trình tự gen thế hệ mới, các oligonucleotide được gắn vào đầu của tất cả các đoạn axit nucleic cần giải trình tự và sau đó, một đoạn mồi phổ quát sẽ được sử dụng để giải trình tự.

DNA Microarrays

Các microarray có nhiều điểm ADN cực nhỏ, thường là các oligonucleotide, được liên kết trên một giá đỡ vững chắc.

Mục tiêu khảo nghiệm có thể là ADN, cDNA hoặc cRNA. Tùy thuộc vào hệ thống, sự lai ghép của mục tiêu với các điểm cụ thể được phát hiện bằng huỳnh quang, phát quang hóa học hoặc keo bạc hoặc vàng. Các microarray được sử dụng cho nhiều ứng dụng như đo đồng thời sự biểu hiện của số lượng lớn gen, cho phép phân tích biểu hiện gen trên toàn bộ gen, cũng như nghiên cứu kiểu gen bằng phân tích đa hình đơn nucleotide (SNP).

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

FISH là một công cụ quan trọng để phát hiện và định vị ADN hoặc ARN trong tế bào và mô.

Các đoạn ADN hoặc oligonucleotide có thể được sử dụng làm mẫu dò.

Oligonucleotide cho kỹ thuật FISH thường có các đặc điểm sau:

• Thường dài 20–30 nucleotide.
• Có thể dán nhãn trực tiếp bằng thuốc nhuộm huỳnh quang như Cy3 hoặc Cy5.
• Ghi nhãn bằng digoxigenin hoặc biotin thường được kết hợp với kháng thể thứ cấp huỳnh quang.
• Được dán nhãn ở các đầu hoặc bên trong ở nhiều vị trí để tăng độ nhạy.
• Nhiều oligonucleotide không chồng chéo thường được sử dụng.

Sau khi lai các đầu dò với mục tiêu, kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để xác định vị trí của các đầu dò và trong một số trường hợp ước tính mức độ huỳnh quang.

FISH được sử dụng trong cả nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu lâm sàng; kỹ thuật này cũng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu bệnh lý.

Oligonucleotide antisense

Các oligonucleotide antisense được sử dụng để làm giảm mức độ tổng hợp protein bằng cách ức chế quá trình xử lý hoặc dịch mã mRNA. Cách tiếp cận này là nền tảng của nhiều liệu pháp hiện đang được thử nghiệm lâm sàng, bao gồm một loạt các phương pháp điều trị ung thư.

Liệu pháp antisense hiện đang có sẵn cho bệnh viêm võng mạc do cytomegalovirus (cytomegalovirus retinitis) và tăng cholesterol máu mang tính chất gia đình (familial hypercholesterolemia).

Một oligonucleotide antisense có một trình tự bổ sung cho một trình tự trong một mRNA cụ thể, dẫn đến sự hình thành một đoạn sợi đôi ngắn.

Các oligonucleotide antisense có thể không được biến đổi hoặc được biến đổi theo một trong nhiều cách khác nhau.

Liệu một oligonucleotide có bị biến đổi hay không sẽ quyết định (các) cơ chế ức chế tổng hợp protein, khả năng các oligonucleotide xâm nhập vào tế bào và tính nhạy cảm của chúng đối với sự thoái hóa.

Cơ chế ức chế là:

• Sự suy thoái RNase H của phần sợi đôi của mRNA (không được sửa đổi).
• Phần sợi đôi làm ngừng hoạt động của máy dịch (tất cả).
• Ngăn chặn các protein nối RNA hoặc liên kết với phức hợp khởi đầu ribosome (morpholinos).

Hiện nay, đối với hầu hết các ứng dụng antisense trong điều trị, các morpholino oligonucleotide nhắm mục tiêu sắp xếp trình tự ngược dòng của vị trí bắt đầu dịch mã AUG hoặc trong vòng 30 cặp bazơ ở hạ lưu AUG là hiệu quả nhất.

Các ứng dụng khác của Oligonucleotide

Có nhiều ứng dụng khác của oligonucleotide trong nghiên cứu và trị liệu. Ba trong số các ứng dụng phổ biến nhất là thiết kế aptamer, thử nghiệm đặc hiệu alen và oligonucleotide tạo thành triplex để liên kết dsDNA.

Aptamer axit nucleic

Aptamer là các chuỗi ADN hoặc ARN liên kết với độ đặc hiệu và ái lực cao với mục tiêu, thường là protein. Tính đặc hiệu là do cấu trúc cấp ba (xoắn ốc…) chứ không phải do trình tự.

Các aptamer được lựa chọn bằng các vòng làm giàu các oligonucleotide ngẫu nhiên hoặc các đoạn thư viện trong một quá trình được gọi là sự tiến hóa có hệ thống của các phối tử bằng cách làm giàu theo cấp số nhân (SELEX). Aptamer thường được sửa đổi để tăng tính ổn định; các hạt nano và thuốc có thể được liên hợp với aptamer.

Aptamer được sử dụng làm cảm biến, điều chỉnh các quá trình tế bào và công cụ trị liệu. Liên kết ái lực cao của aptamer có thể ngăn chặn chức năng của protein. Aptamer liên kết với protein bề mặt tế bào có thể được sử dụng để vận chuyển thuốc. Có nhiều aptamer, chủ yếu là aptamer RNA, được dùng trong các thử nghiệm lâm sàng để điều trị các bệnh bao gồm ung thư, thoái hóa điểm vàng (macular degeneration) và rối loạn đông máu (clotting disorders).

Oligonucleotide đặc trưng cho alen (ASO)

Đầu dò ASO (Allele-Specific Oligonucleotides) được sử dụng chủ yếu trong các “dot-blot” để phát hiện đa hình di truyền (genetic polymorphisms).

Các oligonucleotide thường dài 15–20 nucleotide và chủ yếu được sử dụng để kiểm tra các bệnh có đột biến điểm chung, ví dụ như bệnh xơ nang (cystic fibrosis) và thiếu máu hồng cầu hình liềm (sickle-cell anemia).

Sự liên kết của hai oligonucleotide, một có trình tự kiểu hoang dã và một có trình tự đột biến, được so sánh để xác định xem liệu đột biến có xuất hiện trong mẫu hay không.

Các oligonucleotide hình thành ba lần (TFO)

TFO (Triplex-Forming Oligonucleotides) là các oligonucleotide phù hợp với rãnh chính của ADN.

Chúng thường dài 10–30 nucleotide và liên kết với các chuỗi ADN có trình tự dài purin trên một chuỗi và pyrimidine ở chuỗi kia.

TFO có thể làm giảm sự biểu hiện của gen bằng cách ngăn chặn quá trình phiên mã và cũng đang được nghiên cứu để chỉnh sửa gen trong quá trình tái tổ hợp có mục tiêu nhằm tạo ra những thay đổi có thể di truyền đối với ADN.

(*) Theo Bio-Rad