Oops! It appears that you have disabled your Javascript. In order for you to see this page as it is meant to appear, we ask that you please re-enable your Javascript!

Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconducter, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Giải trình tự gen thế hệ mới

Khởi đầu với sự phát hiện ra cấu trúc DNA, những bước tiến dài đã đạt được trong hiểu biết về tính phức tạp và đa dạng của hệ gen. Một loạt đổi mới về hóa chất cũng như thiết bị đã hỗ trợ cho sự khởi đầu của Dự án Hệ gen người. Tuy nhiên, hạn chế về lưu lượng xử lý và giá thành cao của giải trình tự là những rào cản chính vào thời điểm đó. Sự ra mắt của nền tảng giải trình tự hiệu năng cao đầu tiên vào giữa những năm 2000 đã làm giảm 50.000 lần giá thành giải trình tự hệ gen so với chi phí trước đó của Dự án Hệ gen người, và được đặt tên là: giải trình tự thế hệ mới (NGS). Trong suốt hơn một thập kỷ qua, các kỹ thuật NGS vẫn tiếp tục “tiến hóa” – tăng lưu lượng xử lý lên 100 đến 1000 lần – và đã đóng góp vào những đổi mới mang tính cách mạng để đẩy lùi tính phức tạp của hệ gen. Những tiến bộ này mang lại phép đọc trình tự với độ dài có thể bằng cả hệ gen (hàng tỉ cặp base), đồng thời giá thành cho một lần giải trình tự hệ gen người giảm chỉ còn 1000 USD, vì thế giải trình tự không chỉ bị bó hẹp trong các nghiên cứu cơ bản mà còn là ứng dụng lâm sàng thường ngày. Giải trình tự gen thế hệ mới

Dẫu vậy, những tiến bộ của NGS cũng không phải không có hạn chế. Các nền tảng NGS cung cấp lượng dữ liệu cực lớn, nhưng cũng đi liền với tỉ lệ sai số (~0.1–15%) cao hơn và độ dài mỗi phép đọc thường ngắn hơn (35 – 700 bp đối với các phương pháp đọc trình tự ngắn) so với nền tảng giải trình tự truyền thống của Sanger, đòi hỏi phải kiểm tra kỹ lưỡng các kết quả, đặc biệt nếu muốn phát hiện biến dị và các ứng dụng lâm sàng. Mặc dù giải trình tự đoạn dài đã vượt qua hạn chế về kích thước của NGS, nó vẫn khá đắt đỏ và có lưu lượng xử lý thấp hơn các nền tảng khác. Cuối cùng, NGS đang phải cạnh tranh với các kỹ thuật thay thế khác có khả năng thực hiện các ứng dụng tương tự mà giá lại rẻ hơn, như DNA microarray, NanoString, qPCR. Giải trình tự gen thế hệ mới

Bài viết dưới đây đánh giá các cách tiếp cận khác nhau trong NGS cũng như làm rõ những tiến bộ mới đây trong lĩnh vực này đang thay đổi con đường nghiên cứu hệ gen như thế nào. Các phương pháp được đề cập chi tiết cùng với những ưu thế và nhược điểm. Giải trình tự gen thế hệ mới

Sơ lược

Thế hệ 1: Phương pháp của Frederick Sanger. Dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp chuỗi DNA bằng dideoxynucleotide

Thế hệ 2:

– Phương pháp Pyrosequencing. Đo lượng PPi giải phóng trong phản ứng tổng hợp chuỗi DNA

– Phương pháp Ion Semiconductor. Đo tín hiệu ion H+ giải phóng ra trong phản ứng tổng hợp chuỗi DNA

– Phương pháp của Illumina. Đo tín hiệu từng loại huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp chuỗi DNA Giải trình tự gen thế hệ mới

Thế hệ 3: Giải trình tự dựa trên các kỹ thuật phân tích tín hiệu đơn phân tử. Phân tích tức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp 1 chuỗi DNA trong lỗ nano.

Và đã đang tiếp cận đến thế hệ thứ 4 Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự thế hệ thứ nhất

Nguyên tắc: thực hiện phản ứng PCR với khuôn là trình tự cần biết, quá trình tổng hợp đang diễn ra thì làm ngừng ngẫu nhiên. Hỗn hợp phản ứng chứa các đoạn DNA mới được tổng hợp có kích thước hay điểm làm ngừng tổng hợp đại diện cho tất cả các đoạn DNA khác biệt nhau chỉ một nu. Giải trình tự gen thế hệ mới

Quy trình: trước khi DNA được giải trình tự, nó phải được biến tính thành các mạch đơn nhờ nhiệt độ. Tiếp theo, một mồi gắn vào một trong số các mạch khuôn đơn. Mồi được đánh dấu bằng phóng xạ hay huỳnh quang nên sản phẩm cuối cùng có thể được phát hiện trên bản gel điện di. Khi mồi đã gắn vào DNA, dung dịch được chia làm 4 ống, ghi chú là “A”, “T”, “G”, và “C”. Sau đó các chất được bổ sung vào các ống này:

– Ống “G”: ddGTP và DNA polymerase

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconducter, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Nguyên lý của giải trình tự Sanger

– Ống “A”: ddATP và DNA polymerase

– Ống “T”: ddTTP và DNA polymerase

– Ống “C”: ddCTP và DNA polymerase

Tất cả các ống chứa nồng độ của một loại ddNTP với nồng độ cao hơn hàng trăm lần nồng độ dNTP. Khi tổng hợp DNA đang diễn ra, dNTP được gắn vào mạch đang kéo dài, nhưng ngẫu nhiên ddTNP cũng có thể gắn vào và lập tức làm ngừng chuỗi. Vậy là các sản phẩm khuếch đại mang cách kích thước khác nhau từng nucleotide được tạo ra. Sản phẩm từ bốn ống “A”, “T”, “G”, “C” được biến tính lần 2 và điện di riêng trên gel polyacrylamide nhằm phân tách các sản phẩm theo kích thước. Gel được chiếu tia UV hoặc tia X, chụp ảnh và phân tích.

Sau này, tất cả 4 phản ứng trên được dồn vào một ống và diễn ra đồng thời, trong đó mỗi dNTP được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang riêng biệt. Hỗn hợp sản phẩm được đi qua hệ thống điện di mao quản, phân tách các trình tự khác nhau từng nucleotide.

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Cải tiến từ phương pháp giải trình tự Sanger

Bắt đầu từ thế hệ thứ 2, các kỹ thuật giải trình tự được gọi chung là NGS – next generation sequencing.

Giải trình tự thế hệ 2

2.1. Pyrosequencing Giải trình tự gen thế hệ mới

Pyrosequencing là một phương pháp giải trình tự DNA  dựa trên nguyên lý “đọc trình tự bằng tổng hợp”. Nó khác với giải trình tự Sanger ở chỗ: dựa trên sự phát hiện sự giải phóng pyrophosphate (PPi) khi dNTP được thêm vào chuỗi, thay vì kết thúc chuỗi bằng ddNTP.Giải trình tự gen thế hệ mới Giải trình tự gen thế hệ mới

Tóm tắt quy trình và nguyên lý của pyrosequencing.

Quy trìnhGiải trình tự gen thế hệ mới

Bước 1: Tạo thư viện DNA. DNA được cắt nhỏ thành các mảnh nhỏ (300 – 800 bp) với enzyme cắt đầu tù. Các adapter ngắn (A và B) sau đó được nối vào hai đầu của mỗi mảnh DNA. Các adapter này sẽ làm trình tự mồi cho emPCR và giải trình tự, đồng thời chứa một vị trí bám streptavidin để tinh sạch mẫu. Thư viện DNA khuôn mạch đơn (sst-DNA) ở cuối bước này được đánh giá về chất lượng, và lượng tối ưu cần cho emPCR được xác định bằng chuẩn độ. Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Bước 2: PCR nhũ tương (emPCR) Giải trình tự gen thế hệ mới

Thư viện sstDNA được cố định lên DNA capture bead đặc biệt. Mỗi bead có mang một đoạn sst-DNA duy nhất. Thư viện đính hạt bead được nhũ tương hóa với các hóa chất dùng cho khuếch đại trong một hỗn hợp dầu trong nước. Mỗi bead được bắt giữ riêng rẽ trong một lò phản ứng siêu nhỏ (microreactor) để thực hiện PCR. Sự khuếch đại tạo ra các mảnh DNA giống nhau cố định trên bead và đặc hiệu theo bead. Giải trình tự gen thế hệ mới

Sau khuếch đại đã hoàn tất, hỗn hợp chứa bead được chuyển lên đĩa PicoTiter chứa các giếng  đường kính 44 um – chỉ vừa cho một bead lọt vào. Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Bước 3: Giải trình tự các đoạn DNA đã gắn trên mỗi bead từ theo nguyên lý pyrosequencing

Trước hết, một loại dNTP nhất định được bơm vào các giếng trên đĩa Picotiter.

DNA polymearase xúc tác cho phản ứng kéo dài chuỗi DNA, tại đó các dNTP được liên kết vào chuỗi DNA sẽ giải phóng ra Pyrophosphate (PPi). Số lượng PPi giải phóng sẽ tỷ lệ với số lượng phân tử của 1 loại dNTP được gắn vào chuỗi. Giải trình tự gen thế hệ mới

PPi phản ứng với APS (adenosine 5′-phosphosulfate) để giải phóng ATP dưới sự xúc tác của enzym sulfurylase.

ATP là cơ chất cho luciferase, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa luciferin thành oxyluciferin phát ra ánh sáng nhìn thấy, có thể ghi lại bởi camera. Cường độ sáng sẽ tỷ lệ với số lượng phân tử ATP được tạo thành.

Kết thúc phản ứng, các dNTP còn thừa lại sẽ bị phân hủy bởi ApyraseGiải trình tự gen thế hệ mới

Bốn loại dNTP sẽ được bơm vào trong giếng phản ứng luân phiên nối tiếp nhau.

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Các phản ứng diễn ra trong một lần đọc trình tự bằng pyrosequencing

Bước 4: Ghép nối các đoạn DNA đã được giải trình tự bằng phần mềm tin sinh để tạo ra một trình tự đầy đủ của genome. Giải trình tự gen thế hệ mới

Để hiểu thêm, tham khảo video sau  Giải trình tự gen thế hệ mới

Các thế hệ máy dùng nguyên lý này là Pyrosequencing AB của Viện Công nghệ Hoàng Gia, Uppsala, Thụy điển.và 454 Life Sciences GS của hãng Roche. Với thế hệ giải trình tự này, giá thành giải trình tự genome từ 5000 – 7000 USD giảm còn 1000 – 2000 USD. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Ưu điểm: Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Độ dài đọc được là 400 bp (tương đối dài) với độ chính xác càng về sau càng tăng

+ Công nghệ cao hơn Sanger, giải trình tự hệ gen mà không cần tách dòng tạo thư viện

+ Thư viện DNA có thể được mã hóa và tách riêng trong suốt quá trình phân tích kết quả

– Nhược điểm: Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Khó phân tích chính xác các trình tự của 1 loại Nucleic acid lặp lại liên tục từ 6 nu trở lên, ví dụ TTTTTT

+ Phức tạp và nhiều công đoạn Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Giá thành cao so với các phương pháp thế hệ 2 khác. Giải trình tự gen thế hệ mới

2.2. Ion Torrent sequencing/Ion semiconductor sequencing

Kỹ thuật xác định trình tự các nucleotide trong DNA thông qua việc phát hiện tín hiệu điện do ion H+ được giải phóng ra trong quá trình tổng hợp DNA bằng các máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip cảm ứng bán dẫn.

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Bước 1: Tạo thư viện DNA: Giải trình tự gen thế hệ mới

  • Cắt DNA hệ gen bằng enzyme giới hoạn đầu tù Giải trình tự gen thế hệ mới
  • Gắn 2 đầu adapter A và P1 bằng ligase Giải trình tự gen thế hệ mới
  • Nhân bản đặc hiệu bằng phản ứng PCR các trình tự có 2 đầu A và P1 bằng mồi có trình tự bổ sung với adapter A và P1. Giải trình tự gen thế hệ mới
  • Gắn chọn lọc mạch xuôi và ngược 5’P1 -ssdDNA-3’A lên các microbead (Ion Sphere) với tỷ lệ gắn là 1 bead: 1 DNA. Với việc gắn cả haid đầu, giải trình tự được tiến hành hai chiều, giúp tăng độ chính xác.

Bước 2: PCR nhũ dịch và đưa các bead vào các giếng có chip gắn máy đo pH siêu nhỏ. Mỗi đĩa có khoảng 1,2- 660 triệu giếng tùy theo thế hệ máy. Giải trình tự gen thế hệ mới

Bước 3: Giải trình tự các đoạn DNA đã gắn trên mỗi bead theo nguyên lý ion semiconductor.

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Đầu tiên, một loại dNTP được bơm vào các giếng trên đĩa.

DNA polymearase xúc tác cho phản ứng kéo dài chuỗi DNA, tại đó từng

dNTP được thêm vào chuỗi DNA sẽ giải phóng ra PPi và H+. Số lượng H+ giải phóng sẽ tỷ lệ với số lượng phân tử của 1 loại dNTP được gắn vào chuỗi.

H+ giải phóng sẽ làm giảm pH và tăng điện tích ở khay cảm ứng bán dẫn, dẫn tới chênh lệch điện thế của bộ phận truyền cảm ứng và xuất hiện dòng điện. Tín hiệu điện hóa sẽ được ghi nhận bởi phần mềm máy tính.

Từng loại dNTP sẽ được bơm vào trong giếng phản ứng luân phiên nối tiếp nhau. Giải trình tự gen thế hệ mới

 

 

 

Bước 4: Ghép nối các đoạn DNA đã được giải trình tự bằng phần mềm tin sinh để tạo ra một trình tự đầy đủ của genome. Giải trình tự gen thế hệ mới

Các thế hệ máy Ion Torrent PGM hiện nay: PGM314, PGM316, PGM318, PI, PII (2015)

– Ưu điểm: Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Sử dụng công nghệ bán dẫn chứ không phải quang học để đo tín hiệu nên thời gian nhanh, hệ thống máy gọn nhẹ

+ Thời gian nhanh: 2-3 giờ để phân tích hệ gen người Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Giá thành hóa chất rẻ hơn so với các kỹ thuật giải trình tự NGS khác Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Thư viện DNA có thể được mã hóa và tách riêng trong suốt quá trình phân tích kết quả

– Nhược điểm Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Chiều dài đọc chỉ khoảng 100-250 bp (độ chính xác 99% tại base thứ 250 và cao hơn ở các base phía trước)

+ Các bước thao tác phức tạp, nhiều công đoạn Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Giá thành hóa chất vẫn cao so với pp Sanger Giải trình tự gen thế hệ mới

+ Khó đếm được chính xác trình tự lặp lại liên tục của 1 loại nucleotide (vd 7 nucleotide A khó phân biệt với 8 nucleotide A) Giải trình tự gen thế hệ mới

2.3. Illumina (Solexa)

Quy trình Giải trình tự gen thế hệ mới

Bạn nên xem video giới thiệu của Illumina trước: Giải trình tự gen thế hệ mới

Bước 1. Tạo thư viện Giải trình tự gen thế hệ mới

– Cắt DNA genome thành các mảnh DNA Giải trình tự gen thế hệ mới

– Điện di để chọn lọc các mảnh DNA có kích thước khoảng 200-300 bp. Giải trình tự gen thế hệ mới

– DNA được xử lý để mặc định gắn thêm 1 A vào đầu 3’ hoặc 5’ của mỗi mạch đơn. Sau đó 2 loại PE adapter có chữ T nhô ra được nối với DNA đích (PE adapter). PE adapter có vùng bám cho mồi PCR vì thế cho phép khuếch đại DNA đích với mồi mà ở đầu 5’ có gắn thêm trình tự Index2-P5 và Index1-P7 (có thể chỉ cần 1 Index cũng được). (tổng cộng phần gắn thêm khoảng 60 nu). Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing, Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Bước 2. Polony-PCR tạo các cluster DNA

– Trên một tấm kính có các giếng phủ đầy các mồi bổ sung với P5 và P7, đã cố định đầu 5’ trên mặt giếng. DNA thư viện đã tạo ở trên được biến tính thành mạch đơn (bằng NaOH) và thả vào giếng để cho liên kết bổ sung với mồi. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Mỗi mạch đơn DNA được nhân bản thành hàng triệu (n) copy bằng kỹ thuật PCR theo nguyên tắc “bắc cầu”, hình thành các cụm trình tự (cluster) Giải trình tự gen thế hệ mới

– Cắt và rửa loại bỏ mạch bổ sung (Rv-ngược) và giữ lại mạch chính (Fw-xuôi) để toàn bộ các trình tự trên cluster là 1 chiều phục vụ cho việc giải trình tự chiều thứ nhất. Giải trình tự gen thế hệ mới

Bước 3. Giải trình tự DNA trong từng cluster Giải trình tự gen thế hệ mới

– Thả DNA polymerase và mồi vào (mồi lúc này gọi là Read1 Seq primer bắt cặp bổ sung với PE adapter) cùng với 4 loại nu gắn huỳnh quang mang gốc khóa ở 3’OH. Nu bắt cặp bổ sung được gắn vào nhưng phản ứng tạm dừng lại. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Tia Laser chiếu vào để kích thích phát huỳnh quang và một camera ghi lại huỳnh quang tương ứng với nu

– Gốc khóa được cắt ra, huỳnh quang cũng bị loại bỏ và rửa trôi cùng với các nu không gắn. Chu trình lặp lại đến khi hết độ dài trình tự quan tâm (hết 1 chiều). Sản phẩm đọc chiều 1 được rửa đi.

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

– Tiếp tục bổ sung Index1 primer và các thành phần PCR , cơ chế giải trình tự tương tự trên đến khi hết phần Index, sản phẩm đọc được rửa đi. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Một lần nữa PCR bắc cầu lại được lặp lại tạo thành cụm, nhưng lần này DNA gắn với mồi xuôi (Fw) bị cắt và rửa trôi. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Thả DNA polymerase và mồi vào (mồi lúc này là Read2 Seq primer bắt cặp với PE’ adapter) cùng với 4 loại nu gắn huỳnh quang. Giải trình tự tiếp tục. Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Ảnh chụp một tấm kính nền gắn các cluster trình tự trong lúc giải trình tự diễn ra.

Bước 4: Ráp nối các đoạn trình tự ghi nhận được và xử lý kết quả. Giải trình tự gen thế hệ mới

Các hệ thống máy cho Illumia Seq: HiSeq, HiScanSQ, Genome Analyzer llx, MiSeq

– Ưu điểm:

+ 4 loại nucleotide được gắn huỳnh quang khác nhau nên có thể phân tích được các trình tự của 1 loại nucleotide lặp lại liên tục

+ Thư viện DNA có thể được mã hóa và tách riêng trong suốt quá trình phân tích kết quả

+ Cộng đồng các nhà khoa học sử dụng hệ thống này phổ biến hơn Torrent (Ion) sequencing

– Nhược điểm:

+ Giá thành hóa chất vẫn cao so với Sanger và ion torrent

+ Chiều dài đọc chỉ khoảng 200-250 (độ chính xác 99% tại base thứ 250 và cao hơn ở các base phía trước)

+ Thời gian lâu: 23 giờ để phân tích hệ gen người

So sánh 3 đại diện của 3 hệ thống giải trình tự thế hệ 2Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Giải trình tự thế hệ 3 – Single molecular Real Time Sequencing (SMRT)

Nguyên tắc

Phản ứng giải trình tự gen tức thời đơn phân tử được thực hiện trong một lỗ kích thước nano với tính chất đặc biệt: cho phép quan sát tín hiệu huỳnh quang đơn phân tử khi chất huỳnh quang tiến sát vào đáy của lỗ nano (Zero-Mode Waveguide, ZMW). Giải trình tự gen thế hệ mới

Quy trình

– Genome được phân cắt bởi enzym giới hạn thành các đoạn cỡ 3000- 15000 bp. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Các đoạn DNA được gắn với adaptor để primer có thể bắt cặp. Giải trình tự gen thế hệ mới

– DNA được ủ trong các lỗ nano đã chứa DNA polymerase cố định trong đáy lỗ. Giải trình tự gen thế hệ mới

– Mỗi DNA sẽ được giải trình tự theo cơ chế tổng hợp DNA với 4 loại dNTP gắn 4 loại dye huỳnh quang khác nhau ở gốc phosphate. Tại một thời điểm, chỉ có dNTP nào bổ sung với trình tự quan tâm mới đến đủ gần đáy lỗ và ngay trước khi được gắn vào chuỗi, tín hiệu huỳnh quang mà dNTP mang được ghi nhận trong một khoảnh khắc bởi camera cực nhạy, ngay lập tức sau đó fluorescent bị cắt và trôi nổi trong môi trường.

– Toàn bộ trình tự được giải của các mảnh DNA sẽ được ghép nối và phân tích số liệu bằng phần mềm tin sinh học. Giải trình tự gen thế hệ mới Giải trình tự gen thế hệ mới Giải trình tự gen thế hệ mới

Video về giải trình tự thế hệ 3 – SMRT Giải trình tự gen thế hệ mới

* Thông số của hệ thống máy giải trình tự nguyên lý SMRT của Pacific Bioscience RS

Giải trình tự thế hệ thứ 4 – Oxford Nanopore DNA Sequencing Technology

Giải trình tự tức thời dựa trên tín hiệu điện phân tử Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Phương pháp này sử dụng dòng điện để vận chuyển một mẫu chưa biết qua một lỗ đường kính chỉ 1 nm. Một protein nanopore được gắn lên một màng polymer không dẫn điện. Hệ thống này luôn chứa một dung dịch điện ly – khi mà đặt vào một điện trường không đổi, một dòng điện có thể xuất hiện trong hệ thống. Độ lớn của cường độ dòng điện qua bề mặt lỗ nano phụ thuộc vào kích thước của lỗ nano cũng như thành phần của DNA/RNA đang mắc tại lỗ nano đó. Khi đủ gần với lỗ, các mẫu làm thay đổi đặc trưng về cường độ dòng điện qua bề mặt lỗ. Tổng điện tích qua lỗ bằng tích phân mặt của cường độ dòng điện chảy qua bề mặt lỗ giữa khoảng thời gian t1 và t2.

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

Nanopore và các hệ thống máy giải trình tự thế hệ 4

Hai loại lỗ nano đang được quan tâm là Alpha hemolysin (αHL) từ vi khuẩn và Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) để ứng dụng cho giải trình tự. Giải trình tự gen thế hệ mới

Hiện nay có 3 thiết bị giải trình tự ứng dụng nguyên tắc này. MinION flow cell có kích cỡ bỏ túi, chứa tới 512 kênh nanopore. GridION sử dụng 5 MinION đồng thời. PromethION chứa 48 flow cell có thể hoạt động riêng rẽ, mỗi cell có đến 3000 lỗ nano. Giải trình tự gen thế hệ mới

Giới thiệu nhanh các thông số của một số hệ thống máy giải trình tự hiện nay

Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing, Giải trình tự, Giải trình tự là gì, giải trình tự gen, giải trình tự gen thế hệ mới, next generation sequencing, ứng dụng của giải trình tự, các kỹ thuật giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới nhất, máy giải trình tự, Giải trình tự Sanger, Sanger sequencing, giải trình tự Illumina, Illumina sequencing, Ion torrent, ion semiconductor, pyrosequencing, SMRT, nanopore sequencing,

TỔNG KẾT

Trong một vài năm tới, chắc chắn sẽ có thêm những người nhập cuộc để tiếp tục dân chủ hóa lĩnh vực này với các giải pháp giải trình tự mới. GenapSys (đối tác của Sigma-Aldrich), với máy giải trình tự kích cỡ bằng “hộp cơm trưa”; Genia (Roche) với phương pháp giải trình tự nanopore mới; và gần đây là Firefly (Illumina) với công nghệ CMOS đơn kênh, tất cả họ đều tuyên bố sẽ đi đầu về giá thành và tiết kiệm thời gian cho các ứng dụng lâm sàng. Cuối cùng, NanoString Technologies với phương pháp lai không dùng enzyme, GnuBio (Bio-Rad) với phương pháp dựa vào FRET và Electron Optica với một hệ thống dựa vào hiển vi điện tử, đều nhằm cách mạng hóa việc giải trình tự. Các kỹ thuật NGS hiện nay và sắp tới mang tiềm năng cho phép cải cách khoa học, bao gồm giải trình tự trực tiếp RNA, protein, theo dõi thời gian thực hệ gen của vật gây bệnh hoặc y học cá thể dựa vào giải trình tự hệ gen của từng người. Giải trình tự gen thế hệ mới

Các bạn có thể đọc thêm review này, tuy nhiên sẽ khá khó hiểu.

Nguồn: tham khảo từ nhiều nguồn, kể cả ảnh và video.

Đọc thêm bài viết cùng chuyên mục : Những xu hướng công nghệ sinh học 2017

Thiết kế phức hợp vàng và bạch kim tăng hiệu quả hóa trị

iceberg (tổng hợp)

tapchisinhhoc.com

 

Giải trình tự gen thế hệ mới
5 (100%) 7 votes

Leave a Reply