Nội dung
Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Vâng, bạn đã thiết kế mồi PCR để khuếch đại trình tự mong muốn, và bạn đã sẵn sàng để bắt đầu. Nhưng trừ khi bạn có một nguồn cung cấp khuôn, polymerase bất tận và một máy PCR với chức năng “gradient” – bạn có lẽ sẽ không muốn dùng một tuần sắp tới để tìm ra điều kiện lý tưởng cho phản ứng PCR đâu. Dưới đây là một số mẹo để đạt được điều kiện đó nhanh hơn. (Dù sao thì chức năng “gradient” cũng khá tiện dụng đấy). Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Nhiệt độ gắn mồi và nhiệt độ nóng chảy
Nơi mà bạn đặt thiết kế mồi oligo sẽ cung cấp nhiệt độ nóng chảy (Tm), kèm theo oligo mà họ tổng hợp cho bạn. Tuy nhiên, các công ty khác nhau có thể ước tính Tm khác nhau một chút, phụ thuộc vào cách tính của họ. Công cụ OligoAnalyzer trên trang web của IDT thực sự hữu ích khi xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu. Tuy nhiên, nếu bạn muốn tự làm điều đó, đây là công thức dùng cho các oligo ngắn: Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Tm= 2(A+T) + 4(G+C), trong đó A, T, G, C là số nu tương ứng trong trình tự mồi.
Vì nồng độ muối (Na+) của phản ứng có thể ảnh hưởng đến sự gắn mồi, Tm có thể được tính chính xác hơn bằng công thức : Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Tm = 81.5 + 16.6(log[Na+]) + 0.41(%GC) – 675/độ dài mồi Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Nhiệt độ nóng chảy chịu ảnh hưởng của nồng độ muối trong đệm, pH và nồng độ mồi, nhưng đó chỉ là những mối bận tâm nhỏ. Nếu có bất kỳ cấu trúc bậc hai nào, nhiệt độ gắn mồi nên cao hơn đáng kể Tm (tối thiểu 10 độ). Điều này sẽ ngăn cản các mồi tự khuếch đại lẫn nhau. Công cụ OligoAnalyzer cũng sẽ kiểm tra xem mồi có thể tạo thành cấu trúc bậc hai hay không trong quá trình thiết kế mồi.
Chúng tôi khuyên rằng nhiệt độ gắn mồi được đặt thấp hơn 3oC so với nhiệt độ Tm thấp nhất của các mồi. Ví dụ, nếu mồi xuôi có Tm là 62oC và mồi ngược có Tm là 61oC, chúng tôi gợi ý nhiệt độ gắn mồi có thể là 58oC.
Nếu bạn may mắn được sử dụng một máy PCR với chức năng “gradient” và đủ khuôn để chuẩn bị PCR lặp lại 2 hoặc 3 lần, tôi muốn gợi ý hãy thử một dải nhiệt độ gắn mồi và đánh giá nhiệt độ nào cho kết quả tốt nhất.
Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là cần thiết cho PCR. Nó thường được xác định dựa vào nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi – khuôn. Nhưng, Tm mồi chịu ảnh hưởng của nhiều thành phần khác nhau trong đệm, kể cả nồng độ mồi và khuôn, nên bất kỳ Tm nào được tính toán chỉ là tương đối. Vì thế, thường rất khó để tì ra nhiệt độ gắn mồi chính xác cho sự kết hợp khuôn-mồi nhất định. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Nhiệt độ gắn mồi quá thấp có thể dẫn đến sự hình thành primer-dirmer và sản phẩm không đặc nhiệt trong khi Tm quá cao làm giảm lượng sản phẩm do mồi bám kém. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Sử dụng Touchdown PCR (TD-PCR) Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Bằng việc sử dụng nhiệt độ cao hơn so với Tm ở các chu kỳ đầu tiên, touchdown PCR chỉ cho phép tạo thành và tích tụ các bản sao mang tính bổ sung mồi – khuôn cao nhất. Các giai đoạn giảm nhiệt độ sau đó hạn chế việc thu được ít sản phẩm bằng việc sử dụng bản sao khuếch đại mà giờ đây đang thắng thế so với các sản phẩm không đặc hiệu cũng như primer-dimer nào khác có mặt. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Điều kiện cho TD-PCR như thế nào? Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Quy trình được công bố trên Nature Protocols hoạt động rất tốt và là một sự tham khảo rất tốt để bắt đầu với TD-PCR. Chu trình được gợi ý gồm có 2 giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất sử dụng một Tm cao hơn khoảng 10oC so với Tm tính toán. Nhiệt độ giảm 1oC sau mỗi chu kỳ cho đến khi bằng với Tm tính toán. Việc đó cần tổng cộng 10 – 15 chu kỳ. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Giai đoạn thứ hai là khuếch đại PCR thông thường với 20 – 25 chu kỳ sử dụng nhiệt độ gắn mồi đạt được cuối cùng trong giai đoạn touch-down. N hững mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Số chu kỳ và nhiệt độ giảm trong pha touchdown có thể được điều chỉnh thành từ 1 – 3 chu kỳ cho mỗi bước giảm 1 – 3oC nếu vẫn không thấy hoặc thấy sản phẩm đặc hiệu chưa rõ ràng.
Cre: McMaster University
Các mẹo chung cho TD-PCR: Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
- Giữ toàn bộ phản ứng lạnh cho đến khi chu trình nhiệt bắt đầu là rất quan trọng để tránh gắn mồi không đặc hiệu, kể cả là TD – PCR.Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
- “Hot start” được khuyên dùng hơn. Vì mục đích chính của TD – PCR là loại bỏ các tương tác không đặc hiệu trong khi khởi đầu chu trình, nên áp dụng hot – start khá quan trọng.
- TD – PCR có thể xác định các vấn đề với các phản ứng đơn chứ không phải phản ứng đa mồi.
- Tổng số chu kỳ PCR, bao gồm cả các chu kỳ của pha touch – down nên thấp thôi (dưới 35 chu kỳ). Quá nhiều chu kỳ sẽ dẫn đến sự tạo thành các băng không đặc hiệu.
- Thêm một chu kỳ biến tính một phút ở 96 – 97oC có thể rất hữu dụng cho các trình tự khó.
Thời gian kéo dài
Đã bao giờ bạn tự hỏi đã ai đưa ra một chu trình luân nhiệt cho tất cả mọi người đều dùng được? Trong khi thời gian biến tính và gắn mồi có thể khá cố định trong quá trình chuẩn điều kiện, thời gian kéo dài có thể thay đổi đáng kể dựa vào kích thước của đoạn khuếch đại. Chuẩn mực thông thường là cho phép thời gian kéo dài 60 giây cho mỗi đoạn dài 1 kilobase (1000 nu). Ví dụ bạn muốn khuếch đại đoạn 2 kb, bạn có thể đặt thời gian kéo dài trong mỗi chu kỳ là 120 giây. Với các trình tự đích ngắn hơn, giảm thời gian kéo dài. Như với trình tự quan tâm dài 200 bp, sao chép trong 15 – 20 giây là đủ. Thời gian kéo dài quá lâu sẽ tăng sản phẩm phụ.
(Về chu trình luân nhiệt, sẽ có một bài chi tiết sau)
Lựa chọn enzyme khuếch đại
Taq polymerase được sử dụng thường xuyên nhất trong PCR. Pyrococcus furiosus(PFU) polymerase cũng thường được dùng cho PCR và có tần số sao chép lỗi thấp hơn Taq polymerase. Tuy nhiên, có các enzyme khác hoạt động hiệu quả hơn hoặc kém hơn tùy theo khuôn khác nhau. Ví dụ, nếu vùng khuếch đại của bạn giàu G-C (trên 65%), thì enzyme như Accuprime G-C Rich DNA Polymerase cung cấp bởi Thermo Scientific sẽ phù hợp hơn.
Hot-start PCR Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Kể cả để hỗn hợp phản ứng PCR chốc lát ở nhiệt độ thấp hơn Tm rất nhiều cũng có thể gây ra primer – dimer hoặc gắn mồi không đặc hiệu. Phương pháp hot – start PCR (D’Aquila et al. 1991; Erlich et al. 1991; Ruano et al. 1992) có thể giảm đáng kể vấn đề này. Mục đích là giữ tối thiểu một thành phần quan trọng không thể tham gia phản ứng cho tới khi nhiệt độ của chu trình đầu tiên vượt qua Tm của mồi – khuôn. Thành phần thường được chọn đó là Taq polymerase, bằng cách dùng kháng thể của Taq (TaqStart Antibodies, Clontech; JumpStart Taq, Sigma) ngăn cản enzyme này hoạt động cho tới khi kháng thể bị biến tính bởi nhiệt độ cao trong chu trình đầu tiên.
DNA khuôn
Sử dụng khuôn có chất lượng cao! Tuy nhiên, dùng quá nhiều DNA sẽ giảm tính đặc hiệu của phản ứng, tăng khả năng khuếch đại các sản phẩm không mong muốn. Bởi vì PCR rất nhạy, hãy có gắng sử dụng ít khuôn nhất có thể. Bắt đầu với lượng khuôn DNA từ 1 pg – 10 ng nếu là plasmid, 1 – 100 ng nếu là DNA tổng số trong mỗi phản ứng 50 ul. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhấtNhững mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Mồi
Ai đó có thể dành cả ngày để nói về việc thiết kế tối ưu cho mồi PCR (về độ dài, thành phần GC, nhiệt độ Tm, cấu trúc bậc 2, v.v…). Tuy nhiên, ở đây, chúng tôi chỉ đơn thuần đề cập đến tầm quan trọng của nồng độ mồi tối ưu. Nếu bạn cho quá nhiều mồi thì sẽ tăng khả năng mồi bám vào trình tự không đặc hiệu hoặc mồi tự bám vào nhau (primer-dimer). Quy tắc chung là nồng độ mồi tổng cộng là 1 uM. Để tăng tính đặc hiệu, bạn có thể giảm đến còn 0.1 uM, tuy nhiên sẽ làm giảm sản phẩm PCR thu được.Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Thành phần đệm
Khi bạn mua enzyme polymerase, một đệm tối ưu thường sẽ đi kèm theo enzyme. Sử dụng đệm này theo hướng dẫn của nhà sản xuất là giải pháp an toàn nhất. Tuy nhiên, quan trọng bạn phải hiểu các thành phần mà đệm và sự đóng góp của chúng vào hiệu suất PCR. Phần lớn đệm thường là sự kết hợp đơn giản của các muối – như KCl và MgCl2 – ở giá trị pH tối ưu. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
Ion Magie
Ion Mg là một cofactor cho Taq và hoạt động như chất xúc tác, tức là không có Mg – một thành phần tưởng như không quá quan trọng – phản ứng khuếch đại không diễn ra. Trong quá trình PCR, Mg2+ bám vào nhóm phosphate alpha của dNTPs và giúp loại bỏ phosphate beta và gamma (pyrophosphate) khỏi dNTP. Việc tăng nồng độ Mg2+ làm tăng hoạt tính của Taq polymerase nhưng giảm tính đặc hiệu, và ngược lại. Điều này được giải thích là vì Mg2+ làm tăng Tm của hai mạch DNA bằng cách trung hòa bớt điện tích âm của bộ khung phosphodiester và giảm tương tác tĩnh điện kị dấu giữa hai mạch DNA, tức là làm bền vững hơn liên kết hidro giữa hai mạch. Theo cách này, các mồi không bám ổn định với một số trình tự dưới điều kiện “thường” có thể bám chặt hơn nếu nồng độ Mg2+ cao; điều đó cũng đúng nếu mồi bắt cặp không đặc hiệu thì Mg2+ cao sẽ làm cho dễ hình thành sản phẩm phụ.
Vì thế, nồng độ Mg có thể được tùy chỉnh để thay đổi hiệu suất và độ tin cậy của PCR. Đối với Taq DNA polymerase, nồng độ Mg là 1.5 đến 2 mM. Bởi vì các đệm khác và các thành phần phản ứng có thể bắt giữ Mg, có lẽ cần thiết phải tăng nồng độ Mg. Những mẹo chuẩn điều kiện PCR nhanh nhất
dNTPs
Nồng độ của dNTPs có thể tác động đến cả tính đặc hiệu và lượng sản phẩm PCR. Nồng độ dNTPs quá cao làm giảm tính đặc hiệu, mặt khác nó có thể bắt Mg2+ làm giảm hoạt tính của Taq polymerase. Vì thế trong trường hợp bạn đang chuẩn điều kiện, độ đặc hiệu là quan trọng hơn, hãy dùng 50 uM dNTP (mỗi loại) cho PCR thông thường. Bạn có thể tăng nồng độ đó lên thành 200 uM nếu muốn thu được nhiều sản phẩm.
Hy vọng những mẹo nhỏ này giúp các bạn chuẩn hóa điều kiện PCR nhanh nhất.
Tham khảo Bitesize bio, New England Biolabs
Bài viết liên quan:
iceberg (tổng hợp)
tapchisinhhoc.com
No Responses