Tổng quan Western blot (thẩm tách miễn dịch)

Western blot (thẩm tách miễn dịch) – tổng quan

Western blot là gì?

Thuật ngữ “blotting” chỉ công việc chuyển các mẫu sinh học từ gel sang màng và sau đó là phát hiện chúng trên bề mặt của màng.

Một thí nghiệm Western blot/protein immunoblot (hay còn gọi là thẩm tách miễn dịch, vì một kháng thể được sử dụng để phát hiện đặc biệt kháng nguyên của nó) đã được giới thiệu bởi Towbin và cộng sự vào năm 1979 và hiện là một kỹ thuật thường quy để phân tích protein.

Tính đặc hiệu của tương tác kháng thể – kháng nguyên cho phép xác định được protein đích trong một hỗn hợp protein phức tạp. Western blot có thể cho ra kết quả định tính và bán định lượng về protein quan tâm.

Sơ lược các bước trong Werntern blot – thẩm tách miễn dịch

Bước đầu tiên trong quy trình Western blot là phân tách các đại phân tử trong mẫu bằng cách sử dụng điện di gel. Sau đó, các phân tử đã tách ra được chuyển (blotting) sang một màng thứ hai, thường là màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride (PVDF).

Tiếp theo, màng được khóa (blocking) để ngăn chặn bất kỳ sự liên kết không đặc hiệu nào của kháng thể với bề mặt của màng. Thông thường, protein đã được chuyển sau đó được kiểm tra với các kháng thể: một kháng thể đặc hiệu với protein quan tâm (kháng thể sơ cấp) và một kháng thể khác đặc hiệu với loài vật chủ tạo ra kháng thể sơ cấp (kháng thể thứ cấp).

Thông thường kháng thể thứ cấp được tạo phức với một enzyme, khi kết hợp với cơ chất thích hợp sẽ tạo ra tín hiệu có thể phát hiện được.

Cơ chất sinh màu tạo ra kết tủa trên màng, dẫn đến thay đổi màu sắc nhìn thấy được bằng mắt. Các phương pháp phát hiện nhạy nhất sử dụng cơ chất phát quang hóa học, chất tạo ra ánh sáng như là sản phẩm phụ của phản ứng enzyme kết hợp với kháng thể.

Cường độ ánh sáng có thể được chụp bằng phim. Tuy nhiên, các thiết bị ghi hình kỹ thuật số dựa trên máy ảnh CCD (charge-coupled device) đang trở thành lựa chọn thay thế phổ biến cho phim để thu tín hiệu phát quang.

Ngoài ra, các kháng thể được gắn huỳnh quang có thể được sử dụng, yêu cầu phát hiện bằng cách sử dụng một thiết bị có khả năng bắt tín hiệu huỳnh quang.

Fluorescent blotting là một kỹ thuật mới hơn và đang ngày càng phổ biến vì nó có khả năng ghép kênh (phát hiện nhiều protein trên một blot). Dù sử dụng hệ thống nào, cường độ tín hiệu sẽ tương quan với sự có mặt nhiều ít của kháng nguyên trên màng.

Các quy trình Western blot có thể khác nhau rất nhiều ở bước phát hiện. Một biến thể phổ biến liên quan đến phát hiện trực tiếp so với gián tiếp.

Với phương pháp phát hiện trực tiếp, một kháng sơ cấp liên hợp với enzyme hoặc chất phát huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng nguyên quan tâm trên màng.

Phương pháp phát hiện này không được sử dụng rộng rãi vì hầu hết các nhà nghiên cứu thích phương pháp phát hiện gián tiếp vì nhiều lý do.

Trong phương pháp phát hiện gián tiếp, một kháng thể chính không đánh dấu được sử dụng trước tiên để liên kết với kháng nguyên. Sau đó, kháng thể sơ cấp được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme hoặc chất phát huỳnh quang.

Các nhãn (hoặc phân tử liên hợp) có thể bao gồm biotin, các đầu dò huỳnh quang như Invitrogen Alexa Flour hoặc DyLight flourophores, và các enzyme liên hợp như horseradish peroxidase (HRP) hoặc Alkaline phosphatase (AP).

Phương pháp gián tiếp cung cấp nhiều lợi thế so với phương pháp trực tiếp, như được mô tả ở dưới.

Western blotting, thẩm tách miễn dịch là gì, Western là gì, quy trình western blot

Phương Pháp Trực Tiếp Phương Pháp Gián Tiếp
ƯU ĐIỂM
  • Chỉ cần một kháng thể
  • Không lo ngại vấn đề với khả năng phản ứng chứng của kháng thể thứ cấp
  • Tín hiệu được khuếch đại  nhờ kháng thể thứ cấp
  • Chọn lọc hàng loạt kháng thể thứ cấp liên hợp (nhãn)
  • Một kháng thể thứ cấp có thể được dùng với nhiều kháng thể sơ cấp
  • Dùng kháng thể thứ cấp không ảnh hưởng tới sự bám đặc hiệu của kháng thể sơ cấp
  • Sử dụng kháng thể thứ cấp được đánh dấu mang lại nhiều lựa chọn cho mục đích pháp hiện nhiều protein
NHƯỢC ĐIỂM
  • Việc đánh dấu có thể ảnh hưởng tới việc bám đặc hiệu kháng nguyên
  • Tín hiệu nền mạnh nếu độ đặc hiệu của kháng thể với đích là yếu
  • Kháng thể sơ cấp liên hợp (nhãn) có thể sẽ đắt
  • Việc chọn lựa kháng thể sơ cấp liên hệ có thể mang hạn chế.
  • Nhuộm không đặc hiệu có thể tăng tín hiệu nền
  • Cần thêm nhiều bước nữa


Phân tách protein bằng điện di

Protein thường được phân tách bằng cách sử dụng điện di gel polyacrylamide (PAGE) để phân tích các protein riêng rẽ trong một mẫu phức tạp hoặc để kiểm tra nhiều protein trong một mẫu.

Khi kết hợp với Western blot, PAGE là một công cụ phân tích mạnh mẽ cung cấp thông tin về khối lượng, điện tích, độ tinh khiết hoặc sự hiện diện của protein. Có một số dạng PAGE và có thể cung cấp các thông tin khác nhau về (các) protein quan tâm.

Ví dụ: PAGE không biến tính tách protein theo tỷ lệ khối lượng – điện tích của chúng. Ngược lại, natri dodecyl sulfate-PAGE, hoặc SDS-PAGE, tách protein theo khối lượng do tất cả protein bị làm cho tích điện âm.

Chuyển protein lên màng

Sau khi điện di, protein phải được chuyển từ gel sang màng. Có nhiều phương pháp đã được sử dụng cho quá trình này bao gồm truyền khuếch tán, truyền mao quản, truyền vết chân không và điện di.

Phương pháp chuyển được sử dụng phổ biến nhất cho protein là điện di (electroelution/electrophoretic) vì tốc độ và hiệu quả chuyển của nó. Trong phương pháp này, gel polyacrylamide chứa protein tiếp xúc trực tiếp với một màng nitrocellulose hoặc màng bất kỳ được kẹp giữa hai điện cực chìm trong dung dịch dẫn điện.

Quá trình này bao gồm việc sử dụng các miếng xốp rỗ và giấy lọc để tạo thuận lợi cho việc chuyển. Khi một điện trường được đặt vào, các protein di chuyển ra khỏi gel polyacrylamide và đi lên bề mặt của màng, tại đó protein được gắn chặt. Kết quả là một màng với một bản sao vị trí của các protein lúc đầu có trong gel polyacrylamide.

Hệ thống chuyển màng Western blot

Hiệu suất chuyển có thể thay đổi đáng kể giữa các protein, phụ thuộc khả năng protein di chuyển ra khỏi gel và xu hướng liên kết với màng trong một điều kiện cụ thể.

Hiệu suất chuyển màng phụ thuộc vào các yếu tố như thành phần của gel, sự tiếp xúc hoàn toàn của gel với màng, vị trí của các điện cực, thời gian chuyển, kích thước và thành phần của protein, cường độ điện trường và sự có mặt hay không của cồn trong đệm.

Sau khi chuyển và trước khi tiến hành lai miễn dịch, tổng protein trên màng có thể được đánh giá bằng nhuộm protein để kiểm tra hiệu suất chuyển.

Bản gel điện di protein cũng có thể được nhuộm để xác nhận rằng protein đã di chuyển ra khỏi gel, nhưng điều này không đảm bảo sự gắn kết hiệu quả của protein với màng.

Bởi vì chất nhuộm có thể cản trở sự liên kết và phát hiện kháng thể, lý tưởng nhất nên chọn một chất protein có thể dễ dàng loại đi.

Ponceau S là chất được sử dụng rộng rãi nhất để nhuộm thuận nghịch trên màng, mặc dù nó có độ nhạy thấp, hình ảnh không tốt và có thể phai màu nhanh chóng.

Hiện nay cũng có các lựa chọn thay thế ưu việt cho nhuộm protein trên màng nitrocellulose hoặc PVDF, cho phép phát hiện lượng protein thấp, chất lượng ảnh tốt và không bị mờ cho đến khi loại bỏ.

So sánh việc nhuộm protein thuận nghịch trên màng với Ponceau S stain. Ảnh: thermofisher

Các hệ thống điện chuyển

Có một số chiến lược điện chuyển. Các phương pháp phổ biến nhất là ướt, bán khô và khô, mỗi phương pháp đòi hỏi phải cân nhắc đặc biệt về thời gian, chi phí và các hóa chất và thiết bị cần thiết.

Chuyển ướt (còn gọi là chuyển bằng bể) mang lại hiệu suất chuyển cao, hệ thống đệm linh hoạt nhưng cần nhiều thời gian và công sức.

Thẩm tách bán khô rất tiện và tiết kiệm thời gian với sự linh hoạt về hệ thống đệm.

Tuy nhiên, thẩm tách bán khô có thể có hiệu quả thấp hơn khi chuyển các protein trọng lượng phân tử lớn (> 300 kDa). Chuyển khô mang lại cả hiệu suất chuyển cao, nhanh, cũng như sự thuận tiện vì không yêu cầu đệm, nhưng có có yêu cầu nhất định với đồ dùng tiêu hao.

Mẹo 1: Gặp vấn đề khi chuyển protein khối lượng lớn?

Thử thêm 0.01 – 0.05% SDS vào đệm chuyển màng để giúp kép protein từ gel lên màng.

Khóa các vị trí không đặc hiệu trên màng

Các màng hỗ trợ được sử dụng trong Western blot có ái lực cao với protein. Do đó, sau khi chuyển protein từ gel, điều quan trọng là phải “khóa” phần bề mặt còn lại của màng để ngăn chặn sự liên kết không đặc hiệu của các kháng thể với màng trong các bước tiếp theo.

Có nhiều đệm khóa màng, từ sữa gầy hoặc huyết thanh thông thường đến protein tinh khiết cao đã được sử dụng để khóa các vị trí tự do trên màng.

Đệm khóa màng sẽ cải thiện độ nhạy của xét nghiệm bằng cách giảm nhiễu nền và cải thiện tỷ lệ tín hiệu  – nhiễu nền.

Không có tác nhân khóa màng nào là lý tưởng cho mọi thí nghiệm vì mỗi cặp kháng thể-kháng nguyên có những đặc điểm riêng. Thử nghiệm các đệm khóa màng là rất cần thiết trong việc tối ưu hóa một thí nghiệm Western blot.

Western blotting, thẩm tách miễn dịch là gì, Western là gì, quy trình western blot

So sánh đệm khóa màng SuperBlock của Thermo với sữa gầy.  Nông độ pha loãng liên tiếp bậc 2 dịch ly giải tế bào HeLa (20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 và 0.3125 µg) được phân tách bằng SDS-PAGE và được chuyển sang màng nitrocellulose (A – C) hoặc PVDF (D, E). Màng lọc được block trong 1 giờ với 5% sữa không béo trong dung dịch đệm Tris và 0,05% Thermo Science Tween 20, hoặc Thermo Science SuperBlock Blocking Buffer trong dung dịch muối đệm phosphate với 0,05% Tween 20. Hai màng được xử lý trong 5 phút bằng Thermo Scientific SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate và được chụp ảnh. Kết quả cho thấy SuperBlock Blocking Buffer vượt trội hơn sữa trong việc phát hiện protein mục tiêu. Ảnh: Thermofisher

Sữa gầy (non-fat milk/casein) Albumin huyết thanh bò (BSA)
ƯU ĐIỂM
  • Rẻ hơn BSA
  • Có sẵn hơn, dễ chuẩn bị từ dạng bột
  • Kết quả rõ ràng hơn vì BSA chỉ chứa một protein, ít cơ hội kháng thể phản ứng chéo.
  • Hoạt động tốt với kháng thể phospho vì albumin là một protein tiết và có xu hướng không bị phosphoryl hóa.
NHƯỢC ĐIỂM
  • Không phù hợp để phát hiện protein bị phosphoryl hóa vì nó chứa phosphoprotein có thể phản ứng với kháng thể, gây ra band không đặc hiệu hoặc nhiễu nền cao
  • Không phù hợp với hệ thống phát hiện avidin-biotin vì sữa chứa biotin
  • Có thể chứa glycoprotein, có thể tăng nhiễu nền khi dùng đầu dò lectin
  • Có thể cần phải lọc để hạn chế “các hạt” bám vào màng, gây nhiễu hạt trong kết quả
  • Đắt hơn sữa gầy
  • Vẫn nên lọc để loạt các hạt

Mẹo 2: Bề mặt màng bẩn?

Nhớ lọc dung dịch đệm khóa màng, nhất là khi dùng sữa gầy. Sữa gầy chuẩn bị từ dạng khô thường không tan hoàn toàn, và phần không tan đó ảnh hưởng đến việc phát hiện tín hiệu.

Công thức của đệm rửa

Giống như các quy trình xét nghiệm miễn dịch khác, Western blot bao gồm một loạt các bước ủ với các hóa chất phục vụ miễn dịch, được xen giữa bằng các bước rửa. Các bước rửa là cần thiết để loại bỏ các hóa chất không liên kết và giảm tín hiệu nền, do đó làm tăng tỷ lệ tín hiệu đích trên nhiễu.

Rửa không đủ có thể dẫn đến tín hiệu nền cao, trong khi rửa quá nhiều có thể dẫn đến giảm độ nhạy vì đã vô tính rửa trôi cả kháng thể hoặc kháng nguyên hoặc cả hai khỏi màng. Cũng như các bước khác trong Western blot, nhiều loại đệm có thể được sử dụng.

Đệm Tris (TBS) và đệm phốt phát (PBS) là dung dịch đệm được sử dụng phổ biến nhất. Trong hầu hết các trường hợp có thể sử dụng thay thế giữa PBS và TBS. Tuy nhiên, có những tình huống nên ưu tiên một trong hai. Ví dụ, nên sử dụng TBS khi sử dụng các hệ thống có kháng thể thứ cấp liên hợp với phosphatase kiềm (AP) hoặc khi phát hiện protein phosphoryl hóa với kháng thể đặc hiệu phospo.

Đôi khi, các công thức của đệm rửa bao gồm một chất tẩy rửa, như 0,05% Tween 20 để hỗ trợ loại bỏ các vật liệu không đặc hiệu. Tùy thuộc vào xét nghiệm cụ thể, lượng chất tẩy rửa trong đệm rửa sẽ khác nhau, tuy nhiên nồng độ điển hình là từ 0,05 đến 0,5% đối với Tween 20.

Một mẹo phổ biến là thêm dung dịch khóa màng đã pha loãng (1:10) vào đệm rửa. Kết hợp chất khóa màng với rửa có thể giúp giảm thiểu tín hiệu nền sau này.

Điều quan trọng cần lưu ý là chất tẩy rửa, cũng như các dung dịch protein, có thể thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật. Mặc dù pha các chất tẩy rửa loãng như NP-40, CHAPS và Tween 20 rất thuận tiện, nấm có thể phát triển trong các dung dịch này, điều này có thể dẫn đến độ nhiễu nền cao.

Ngoài ra, chất tẩy rửa có thể lẫn một lượng đáng kể peroxit sẽ gây ra tín hiệu nền khi sử dụng các cơ chất của horseradish peroxidase. Do đó, điều quan trọng là sử dụng chất tẩy rửa có độ tinh khiết cao.

TBS

PBS TBST PBST
Công thức · 25mM Tris

· 0.15M NaCl

· pH 7.2

· 10mM sodium phosphate

· 0.15M NaCl

· pH 7.5

· 25mM Tris

· 0.15M NaCl

· 0.05% Tween-20

· pH 7.5

· 10mM sodium phosphate

· 0.15M NaCl

· 0.05% Tween-20

· pH 7.5

Kháng thể sơ cấp và thứ cấp

Phương pháp Western blot thường được thực hiện bằng cách thăm dò trên màng đã khóa bằng một kháng thể sơ cấp có khả năng nhận ra một loại protein hoặc epitope cụ thể trên một nhóm protein (ví dụ, domain SH2 hoặc phosphorylated tyrosine). Việc lựa chọn một kháng thể sơ cấp cho một thí nghiệm thẩm tách miễn dịch sẽ phụ thuộc vào kháng nguyên cần được phát hiện và những kháng thể nào có sẵn cho kháng nguyên đó. Cũng cần lưu ý rằng không phải tất cả các kháng thể sơ cấp đều phù hợp với Western blot và vì thế hãy kiểm tra trước khi mua một kháng thể sơ cấp mới.

Nói chung, kháng thể sơ cấp nhận diện protein mục tiêu vốn không thể được phát hiện trực tiếp. Do đó, các kháng thể thứ cấp gắn nhãn được sử dụng để phát hiện kháng nguyên đích (phát hiện gián tiếp). Một loạt các kháng thể thứ cấp được dán nhãn có thể được sử dụng để phát hiện Western blot.

Việc lựa chọn kháng thể thứ cấp phụ thuộc hoặc vào loài động vật sinh kháng thể sơ cấp (loài vật chủ) hoặc vào nhãn liên hợp với kháng thể sơ cấp (ví dụ, biotin, histidine (His), hemagglutinin (HA), v.v.) Ví dụ, nếu kháng thể chính là kháng thể đơn dòng chuột không chỉnh sửa, thì kháng thể thứ cấp phải là kháng thể IgG thứ cấp kháng chuột, thu được từ vật chủ không phải chuột.

Các kháng thể cho Western blot thường được pha loãng và các nhà sản xuất có thể khuyên chúng ta nên sử dụng phạm vi pha loãng 1/100 – 1/500.000 từ dung dịch gốc 1 mg/mL.

Tuy nhiên, độ pha loãng tối ưu của một kháng thể nhất định với một hệ thống phát hiện cụ thể phải được xác định bằng thực nghiệm.

Các hệ thống phát hiện nhạy cảm hơn đòi hỏi ít kháng thể hơn và có thể tiết kiệm đáng kể chi phí kháng thể. Sử dụng lượng kháng thể thấp hơn cũng có thể có ích, giúp giảm nền, vì lượng kháng thể hạn chế làm tăng độ đặc hiệu đối với protein có ái lực cao nhất.

Western blot sử dụng kháng thể alpha (α) -tubulin. Dịch ly giải từ 8 dòng tế bào đã được phân tách bằng hệ thống điện di Invitrogen XCell Surelock và hệ thống thẩm tách khô iBlot. Màng này tìm kiếm protein alpha (α)-tubulin bằng kháng thể sơ cấp đơn dòng của alpha (α) -tubulin từ chuột và kháng thể thứ cấp từ dê liên hợp HRP kháng chuột. Ảnh: thermofisher

Pha loãng kháng thể thường được thực hiện trong bộ đệm rửa.

Sự hiện diện của chất tẩy rửa và một lượng nhỏ chất ngăn chặn trong chất pha loãng kháng thể thường giúp giảm thiểu nền, do đó làm tăng tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm.

Ngược lại, việc thêm quá nhiều chất ngăn chặn hoặc chất tẩy rửa vào dung dịch pha loãng kháng thể có thể ngăn chặn sự gắn kết hiệu quả của kháng thể với kháng nguyên, làm giảm tín hiệu cũng như giảm nền.

Phương pháp phát hiện trong Western blot

Mặc dù có nhiều nhãn khác nhau có thể được liên hợp với một kháng thể thứ cấp hoặc sơ cấp, phương pháp phát hiện được sử dụng sẽ đặt ra hạn chế khi lựa chọn những gì có thể được sử dụng trong xét nghiệm (các việc chọn hóa chất trong các bước trước đó).

Đồng vị phóng xạ đã được sử dụng rộng rãi trong quá khứ, nhưng chúng đắt tiền, hạn sử dụng ngắn, không cải thiện tỷ lệ tín hiệu đích – nhiễu và yêu cầu các thao tác cũng như xử lý xả thải đặc biệt. Các nhãn thay thế là enzymechất phát huỳnh quang (fluorophore).

Nhãn emzyme được sử dụng phổ biến nhất cho Western blot, và mặc dù chúng yêu cầu thêm các bước, enzyme có thể cực kỳ nhạy khi được tối ưu hóa với cơ chất thích hợp.

Horseradish peroxidase (HRP), và ở mức độ thấp hơn, phosphatase kiềm (AP) là hai enzyme được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện protein.

Một loạt các cơ chất sinh màu, chất phát huỳnh quang hay phát quan hóa học có sẵn để sử dụng với một trong hai enzyme.

Alkaline phosphatase cung cấp một lợi thế khác biệt so với các enzyme khác ở chỗ tốc độ phản ứng của nó vẫn tuyến tính, cải thiện độ nhạy bằng cách cho phép phản ứng tiến hành trong một khoảng thời gian dài hơn. Trái lại, thời gian phản ứng tăng lên thường dẫn đến tín hiệu nền cao.

Các kháng thể liên hợp Horseradish peroxidase được coi là vượt trội so với các kháng thể liên hợp AP do kích thước nhỏ hơn của enzyme HRP và khả năng tương thích với các phản ứng liên hợp.

Ngoài ra, tốc độ hoạt động cao, ổn định tốt, chi phí thấp và tính sẵn có của cơ chất làm cho HRP trở thành enzyme được lựa chọn cho hầu hết các ứng dụng.

Các kháng thể liên hợp enzyme cung cấp sự linh hoạt nhất trong việc phát hiện và ghi nhận kết quả cho Western blot vì sự đa dạng của các cơ chất.

Hệ thống phát hiện đơn giản nhất là sử dụng cơ chất tạo màu. Mặc dù không nhạy cảm như các cơ chất khác, cơ chất tạo màu cho phép hình dung trực tiếp sự phát triển tín hiệu.

Tuy nhiên, cơ chất tạo màu có xu hướng mờ dần đối với thẩm tách khô hoặc trong quá trình lưu trữ, làm cho blot trở thành một tư liệu thiếu tin cậy. Mặc dù vậy, khắc phục khá đơn giản là chụp hoặc quét trực tiếp tấm blot để tạo bản sao vĩnh viễn các kết quả Western blot.

Cơ chất phát quang hóa học khác với các cơ chất khác ở chỗ tín hiệu là sản phẩm tức thời của phản ứng enzyme – cơ chất và chỉ tồn tại khi phản ứng xảy ra. Nếu cơ chất được sử dụng hết hoặc enzyme mất hoạt tính, thì phản ứng sẽ chấm dứt và tín hiệu sẽ bị mất.

Tuy nhiên, trong các xét nghiệm được tối ưu hóa tốt bằng cách sử dụng kháng thể pha loãng thích hợp và cơ chất đủ, phản ứng có thể tạo ra ánh sáng ổn định trong 1 – 24 giờ tùy thuộc vào cơ chất, kết quả nhạy và ổn định có thể được ghi lại bằng phim X quang hoặc thiết bị kỹ thuật số.

Trong khi chụp phim X-quang có thể được sử dụng để thu được dữ liệu bán định lượng, chụp ảnh kỹ thuật số nhạy hơn vì phạm vi phát hiện động rộng, cho phép các nhà nghiên cứu có được dữ liệu định lượng từ Western blot.

Việc sử dụng kháng thể liên hợp chất phát huỳnh quang đòi hỏi ít bước hơn vì không có giai đoạn liên quan đến cơ chất.

Mặc dù quy trình ngắn hơn, phương pháp này đòi hỏi thiết bị đặc biệt để phát hiện và ghi lại tín hiệu huỳnh quang do nó đòi hỏi nguồn sáng kích thích.

Những tiến bộ gần đây trong hình ảnh kỹ thuật số và sự phát triển của các chất phát huỳnh quang thế hệ mới hơn như hồng ngoại, cận hồng ngoại và chấm lượng tử đã làm tăng độ nhạy và mức độ phổ biến của việc sử dụng đầu dò huỳnh quang để Western blot và các xét nghiệm miễn dịch khác.

Mặc dù thiết bị và kháng thể liên hợp fluorophore có thể khá đắt tiền, phương pháp này có thêm lợi thế về khả năng tương thích đa kênh (sử dụng nhiều hơn một fluorophore trong cùng một thí nghiệm). Ngoài ra, chất thải hóa học được giảm hơn nữa so với các quy trình thẩm tách miễn dịch khác.

Mẹo 3: Muốn phát hiện peptide?

Thêm 20% methanol vào đệm chuyển để tăng khả năng bám của peptide vào màng. Dùng màng 0.2 μm PVDF để hạn chế trôi mất peptide.

Mẹo 4: Không thu được kết quả “sạch đẹp”?

Nếu bạn sử dụng kháng huyết thanh thay vì kháng thể sơ cấp tinh sạch, điều này có thể gây ra nhiễu nền cao. Hãy thử thêm 100 ul dịch ly giải không chứa protein đích vào kháng huyết thanh, lắc và ủ qua đêm ở 4oC

Rất nhiều gợi ý khắc phục sự cố Western blot (troubleshooting) và lời khuyên sẽ được để cập ở bài viết sau.

Tham khảo thêm

  1. Towbin, et al. (1979) Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications. PNAS76:4350–4354.
  2. Kurien, B.T. and Scofield, R.H. (2009) Introduction to Protein Blotting. In: Protein blotting and detection: methods and protocols. New York: Humana Press. pp 9–22.
  3. Kurien, B.T. and Scofield, R.H. (2009) Non-electrophoretic Bi-directional Transfer of a Single SDS-PAGE Gel with Multiple Antigens to Obtain 12 Immunoblots. In: Protein blotting and detection: methods and protocols.New York: Humana Press. pp 55–65.
  4. Westermeier, R., et al. (2005) Blotting. In: Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations, 4th ed. New York: Wiley-VCH. pp 67–80.
  5. Peferoen, M. (1988) Vacuum Blotting: An Inexpensive, Flexible, Qualitative Blotting Technique. In: Walker, J.M., Ed., Methods in Molecular Biology-New Protein Techniques. New York: Humana Press. Vol. 3, pp 383–393.
  6. Gooderham, K. (1984) Transfer Techniques in Protein Blotting. In: Walker, J.M., Ed., Methods in Molecular Biology-Proteins. New York: Humana Press. Vol. 1, pp 165–177.
  7. Khyse-Andersen, J. (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose Biophys. Meth.10:203.
  8. Tovey, E.R. and Baldo, B.A. (1987) Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes.Electrophoresis 8:384–387.

tapchisinhhoc.com

Có thể bạn cũng quan tâm: Các quy trình tách dòng không sử dụng enzyme giới hạn hoặc ligase

Sơ lược các phương pháp tinh sạch protein

Tham gia Cộng đồng hơn 150,000 nhà khoa học đến từ các Trường Đại học và Viện Nghiên cứu về Công nghệ sinh học.

Cám ơn bạn đã kết nối cùng HVBIOTEK GROUP

Đã có lỗi xảy ra, bạn xem lại các thông tin đăng ký nhé!

HƯỚNG TỚI CÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẠI VIỆT NAM!

Đăng Ký Bản Tin

Tham gia cộng đồng 150,000++ nhà khoa học trong lĩnh vực Công Nghệ Sinh Học tại Việt Nam!

Chào mừng bạn đã tham gia cùng chúng tôi.

Đã có lỗi xảy ra, bạn vui lòng lặp lại quy trình.

HVBIOTEK GROUP