Tách dòng phân tử (ADN tái tổ hợp) căn bản

Tách dòng phân tử (hay nhân bản) truyền thống dựa trên các phương pháp DNA tái tổ hợp bắt đầu bằng việc chuẩn bị một vec tơ để nhận DNA chèn bằng cách cắt bằng một số loại enzyme cắt giới hạn. Các mảnh DNA đã cắt sau đó được ghép lại với nhau bằng một enzyme gọi là ligase để tạo thành một vec tơ mới khả biến biểu hiện một gen quan tâm. Đây có thể là kỹ thuật đơn giản và lâu đời nhất để tách dòng truyền thống và đặt nền tảng cho các nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp tách dòng mới như tách dòng TA, tách dòng TOPO ™, tách dòng PCR, tách dòng không cần gắn và lắp ghép gen khai thác các đặc tính độc đáo của các enzyme chỉnh sửa khác.

Một quy trình chung cho tách dòng truyền thống bao gồm các bước liệt kê trong hình 1

Chuẩn bị vectơ

Các vec tơ được sử dụng trong các phương pháp tách dòng truyền thống dựa trên các plasmid, đó là các chuỗi DNA kép, dạng tròn, có thể sao chép bên trong vi khuẩn độc lập với DNA hệ gen. Tất cả các vectơ tách dòng dựa trên plasmid chứa một số yếu tố quan trọng, bao gồm điểm khởi đầu sao chép của vi khuẩn để nhân lên hiệu quả trong tế bào chủ vi khuẩn; (các) vị trí cắt của enzyme giới hạn hoặc, phổ biến hơn, một vị trí đa điểm cắt (MCS) chứa nhiều vị trí cắt của các enzyme giới hạn và một yếu tố đánh dấu (marker, ví dụ gen kháng kháng sinh) để sàng lọc các vi khuẩn đã nhận vectơ.

Trong một số vectơ, MCS nằm trong trình tự của một gen đóng vai trò là marker và cho phép sàng lọc các khuẩn lạc chứa đoạn chèn. Ví dụ, vectơ pUC18 biểu hiện gen lacZα mã hóa peptide alpha của beta-galactosidase, khi kết hợp với X-gal, cho phép sàng lọc màu sắc của các khuẩn lạc hình thành sau khi tách dòng (xem thêm về sàng lọc màu xanh/trắng ở phần dưới).

Bước đầu tiên trong công tác chuẩn bị vectơ cho tách dòng truyền thống là tạo ra một vị trí chèn bằng cách cắt giới hạn. Sự lựa chọn các enzyme cắt giới hạn phụ thuộc vào sự hiện diện và vị trí của các trình tự nhận biết của chúng trên vectơ và đoạn chèn, cũng như khả năng tương thích của chúng để có thể gắn. Các vị trí cắt giới hạn của vectơ có thể được tìm thấy trên bản đồ vectơ hoặc có thể được định vị bằng các công cụ trực tuyến miễn phí như RestrictionMapper. MCS, nếu có, thường là lựa chọn đầu tiên để cắt, vì vùng này được thiết kế đặc biệt để tách dòng.

Sau khi cắt vectơ, sự khử phospho của vectơ được khuyến nghị để tránh vectơ sau khi cắt giới hạn lại tự đóng vòng lại, nhất là khi đầu tận cùng của vết cắt là các đầu so le . Trong quá trình khử phospho, enzyme alkaline phosphatase loại bỏ các nhóm 5 ′ phosphate ở các đầu trình tự. Điều này ngăn cản sự tự đóng vòng của vectơ vì enzyme ligase cần cả 5 ′ phosphate và 3 ′ OH để gắn hai đầu trong quá trình khép vòng trở lại của vectơ (xem mục Gắn).

Sự khử phospho của vectơ rất quan trọng để hỗ trợ việc gắn đoạn mong muốn vào vectơ. Cả phân tử vectơ tự đóng vòng và phân tử vectơ mang đoạn chèn có thể được vi khuẩn nhận vào trong quá trình biến nạp và sẽ đều tạo ra tính kháng kháng sinh (xem phần Sàng lọc khuẩn lạc và Hình 6).

Tạo đầu bằng cho các đầu vectơ có thể cũng cần thiết, tùy thuộc vào các enzyme giới hạn mà chúng ta lựa chọn. Việc tinh sạch vectơ sau mở vòng cũng được khuyến nghị để có thể Gắn thành công.

Chuẩn bị đoạn chèn

Các đoạn chèn để tách dòng có thể là DNA hệ gen, một phần của một plasmid khác hoặc một đoạn DNA thẳng. Bất kể loại DNA có nguồn gốc từ đâu, bước đầu tiên trong quá trình chuẩn bị chèn thường là thực hiện quá trình cắt giới hạn nhằm tạo ra các đầu tương thích để ghép nối tiếp vào vectơ.

Giống như với việc chuẩn bị véctơ, các enzyme cắt giới hạn phù hợp để tách dòng đoạn chèn vào vectơ được chọn lựa. Một trong những chiến lược phổ biến nhất là thực hiện cắt đồng thời cả đoạn chèn và vectơ để tách dòng định hướng. Trong ví dụ sau (Hình 3), hai enzyme tạo ra các đầu không tương thích (EcoRI và KpnI) được sử dụng. Vì các đầu vectơ và đoạn chèn chỉ có thể gắn vào nhau theo một chiều do tính tương thích (EcoRI với EcoRI, KpnI với KpnI), nên phương pháp này cho phép đoạn chèn được tách dòng một cách định hướng

Khi thực hiện quá trình cắt giới hạn hai lần (cắt ‘đúp’), điều quan trọng là đệm phản ứng và điều kiện là tối ưu cho cả hai enzyme; do đó, các khuyến nghị của nhà sản xuất trong việc chuẩn bị phản ứng cắt kép nên được tuân thủ chặt chẽ để đảm bảo thành công.

Trong trường hợp không có enzyme cắt giới hạn phù hợp, các đầu DNA tạo bởi enzyme giới hạn đã chọn có thể được làm bằng để tách dòng. Việc làm bằng sẽ làm thay đổi trình tự nguyên gốc gần phần đầu DNA; điều này có thể gây ra một sự dịch khung trong khu vực dịch mã hoặc làm gián đoạn vùng điều hòa gen. Ngoài ra, việc Gắn DNA với các đầu bằng thường có nhiều thách thức và kém hiệu quả hơn so với các đầu so le (đầu dính) (Hình 3B).

Trong một số trường hợp, một enzyme cắt giới hạn có thể được chọn để cắt cả DNA chèn và vector, tạo ra các đầu bổ sung để Gắn (Hình 3C). Phương pháp này thường được sử dụng trong tách dòng DNA hệ gen.

Trong các tình huống khi không thể sử dụng một enzyme cắt giới hạn, một cặp enzyme có trình tự nhận biết khác nhau nhưng tạo ra các phần nhô ra tương thích có thể là một thay thế. Ví dụ: BamHI tiếp nhận trình tự 5′-G|GATCC-3 và BglII tiếp nhận trình tự 5′-A|GATCC-3; cả hai đều tạo ra các phần nhô ra 5′-GATC có thể tham gia phản ứng Gắn. Tuy nhiên, lưu ý rằng không có trình tự nhận biết nào trong số hai trình tự trên được khôi phục sau khi Gắn trong trường hợp này (Hình 3D).

Các enzyme thường được sử dụng để tạo đầu bằng là tiểu phần lớn của DNA polymerase I (Klenow,) hoặc T4 DNA polymerase. Sự lựa chọn polymerase phụ thuộc vào việc enzyme giới hạn tạo ra phần nhô ra 3 ′ hay 5 ′ .. Trong trường hợp 3′ phần nhô ra (ví dụ: cắt bằng KpnI), DNA polymerase T4 được lựa chọn vì nó có hoạt tính 3 ′ – 5′ exonuclease mạnh hơn Klenow. Trong trường hợp này, phần nhô ra 3′ bị cắt bởi T4 DNA polymerase. Đối với 5 ′ phần nhô ra (ví dụ: cắt bằng EcoRI), có thể sử dụng Klenow hoặc T4 DNA polymerase để lấp vào phần nhô ra thông qua hoạt tính 5 ′ – 3 ′ polymerase của chúng. Trong một số trường hợp, nuclease S1 được thêm lượng dư vào, có thể được sử dụng để cắt các đầu DNA mạch đơn lẻ nhô ra thông qua hoạt tính 5 ′ – 3′ exonuclease trên DNA mạch đơn (Hình 4).

Sau khi cắt giới hạn đoạn chèn và vectơ, các đoạn mong muốn có thể được tinh sạch bằng cách chạy các mẫu trên gel agarose và lấy các đoạn quan tâm. Điện di gel cũng loại bỏ các enzyme và muối có trong các phản ứng cắt. Các bộ kit tính sạch gel có sẵn trên thị trường cho quy trình làm việc hiệu quả, kết quả đáng tin cậy và năng suất cao. Các bộ kit dựa trên các quy trình sử dụng tác nhân chaotropic và nhiệt để làm tan gel, sau đó các đoạn được tinh sạch bằng cột silica hoặc hạt từ tính. Để phục hồi nhẹ nhàng và hiệu quả các đoạn DNA dài (ví dụ: > 10 kb), gel có nhiệt độ nóng chảy thấp, kết hợp với enzyme agarase giúp phá vỡ mạng lưới agarose có thể được sử dụng. Phương pháp trước đây để thu hồi axit nucleic từ gel tan chảy là dùng phenol/chloroform, sau đó là kết tủa bằng ethanol. Tuy nhiên, tách chiết bằng phenol/chloroform có thể làm giảm lượng DNA thu hồi và lẫn phenol, có thể ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau này. DNA cần phải rất tinh sạch để Gắn thành công. Phương pháp đơn giản nhất để đánh giá độ tinh khiết là đo độ hấp thụ của nó: DNA nguyên chất có tỷ lệ A260/A280> 1.8 và tỷ lệ A260/A230 xấp xỉ 2.0.

Gắn

Sau khi có được các đoạn quan tâm, một phản ứng gắn có thể được set up để gắn đoạn chèn vào vectơ. Enzim phổ biến nhất được sử dụng để Gắn là T4 DNA ligase, enzyme này tạo liên kết giữa các nhóm 5 ′ phosphate và 3 ′ OH ở các đầu DNA. Phản ứng ligase DNA T4 đòi hỏi ATP, DTT và Mg2+, thường được bổ sung trong bộ đệm phản ứng (Hình 5). Để cải thiện hiệu quả của bước Gắn, một khuyến nghị chung là hãy chuẩn bị nhiều phản ứng với tỷ lệ mol của đoạn chèn : vectơ thay đổi, thường là trong khoảng từ 1:1 đến 5:1. Đối với các phản ứng Gắn kém hiệu quả, như với các đoạn DNA có đầu bằng, việc bổ sung các đại phân tử trơ như polyethylen glycol (PEG) thường được đề xuất để tăng đáng kể nồng độ của các thành phần phản ứng và do đó cải thiện hiệu suất Gắn.

Nhiệt độ phản ứng có thể dao động từ 14 ° C đến 25 ° C (nhiệt độ phòng) và thời gian phản ứng từ 10 phút đến 16 giờ (hoặc qua đêm), tùy thuộc vào loại đoạn DNA và sản phẩm mong muốn. Nói chung, nhiệt độ phản ứng cao hơn đòi hỏi ít thời gian hơn nhưng có thể tạo gây giảm sản phẩm gắn. Bộ kit Gắn DNA nhanh cũng đã có trên thị trường, được tối ưu đặc biệt để đạt được kết quả tương đương chỉ trong 5 phút.

Hỗn hợp sản phẩm Gắn có thể được sử dụng trực tiếp trong quá trình biến nạp các tế bào khả biến bằng hóa chất nhưng có thể phải tinh sạch trước khi biến nạp bằng điện biến nạp. Nếu PEG được sử dụng trong phản ứng Gắn, việc bất hoạt ligase là không cần thiết, vì điều này có thể làm giảm hiệu suất biến nạp.

Biến nạp

Biến nạp là một quá trình xảy ra tự nhiên trong đó các tế bào vi khuẩn nhận lấy DNA ngoại lai với tần số thấp. Trong các ứng dụng sinh học phân tử, quá trình này được khai thác và cải thiện để đưa các plasmid vào bên trong vi khuẩn đã được gây khả biến.

Các tế bào khả biến thương mại đã có sẵn để biến nạp hiệu quả và đáng tin cậy. Phương pháp phổ biến nhất để chuẩn bị vi khuẩn khả biến biến nạp là xử lý tế bào vi khuẩn pha log bằng canxi clorua. Khi các tế bào khả biến hóa học được trộn với DNA từ phản ứng Gắn và sau đó bị sốc nhiệt ở 42°C, một số DNA được hấp thụ bởi các tế bào vi khuẩn.

Có nhiều chủng tế bào khả biến khác nhau, và việc lựa chọn là dựa trên các mục tiêu thí nghiệm và các ứng dụng tiếp theo. Ví dụ, để thực hiện sàng lọc xanh/trắng, một chủng vi khuẩn có đột biến lacZ (lacZΔM15) phải được chọn. Nếu thí nghiệm yêu cầu việc cắt bằng các enzyme giới hạn nhạy với methyl hóa, plasmid nên được bắn vào trong một chủng vi khuẩn dcm–/dam–. Đối với biểu hiện protein, chủng phải tạo điều kiện duy trì ổn định mRNA và dịch mã, cũng như khả năng cảm ứng cao để biểu hiện protein tái tổ hợp.

Ngoài ra, hiệu suất biến nạp của các tế bào khả biến là một tiêu chí quan trọng cần xem xét. Các nhà sản xuất cung cấp hiệu suất biến nạp của các tế bào khả biến theo đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi microgam DNA (CFU /ug), thường dao động từ 10^6 đến 10^9 CFU/ug. Trong các trường hợp Gắn và tách dòng khó khăn hơn, việc chọn các tế bào có hiệu suất biến nạp cao nhất có thể cải thiện đáng kể khả năng có được các dòng mong muốn.

Một phương pháp khác để biến nạp tế bào vi khuẩn là điện biến nạp. Trong kỹ thuật này, các tế bào vi khuẩn được gây biến nạp bằng sốc điện và plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng một dòng điện để tạo ra lỗ trên màng tế bào vi khuẩn để hấp thụ plasmid.

Vi khuẩn biến nạp sau đó được cấy trên đĩa thạch với một loại kháng sinh thích hợp và sàng lọc (bằng cách sàng lọc xanh trắng hoặc phương pháp khác) để chọn ra các khuẩn lạc mang plasmid chứa đoạn chèn mong muốn.

Sàng lọc khuẩn lạc

Sản phẩm biến nạp chứa hỗn hợp các tế bào không có vectơ, vectơ không có phần chèn, chỉ chứa đoạn chèn và vectơ được gắn thành công với phần chèn. Vi khuẩn không có vectơ sẽ thiếu gen kháng kháng sinh và sẽ không phát triển, trong khi vi khuẩn biến nạp với vec tơ (có hoặc không có chèn) tồn tại được trên môi trường thạch kháng sinh do gen kháng kháng sinh biểu hiện (Hình 6). Do đó, kháng kháng sinh cho phép sàng lọc vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp nguyên vẹn.

Để xác định xem các khuẩn lạc được biến nạp có chứa phần chèn hay không, một số phương pháp có thể được sử dụng, trong đó phổ biến nhất là sàng lọc xanh trắng và sàng lọc dương tính. Sàng lọc xanh trắng phụ thuộc vào việc biến nạp một chủng vi khuẩn biểu hiện gen lacZ đột biến (lacZΔM15) nên không thể mã hóa peptide alpha của beta-galactosidase, nhưng được bù đắp bởi vector mang gen. Các tế bào biến nạp được cấy trên môi trường tăng trưởng bao gồm một chất cảm ứng phiên mã cho biểu hiện lacZ, IPTG và cơ chất tạo màu của LacZ là X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl–D-galactopyranoside). Trong sàng lọc xanh/trắng, LacZ sẽ thủy phân X-gal, tạo ra chất màu xanh lam và do đó khuẩn lạc có màu xanh. Khi một đoạn DNA chèn vào làm phá vỡ gen lacZα trên vectơ, không có LacZ đầy đủ được hình thành và các khuẩn lạc biến nạp có màu trắng (Hình 7).

Một phương pháp sàng lọc phổ biến khác là sàng lọc dương tính, theo đó một gen gây chết cho vật chủ vi khuẩn nằm trong MCS của vectơ. Việc Gắn thành công một phần chèn vào gen gây chết trong MCS ngăn chặn biểu hiện của nó, chỉ cho phép các tế bào biến nạp chứa vectơ mang đoạn chèn được tồn tại.

Để xác định cụ thể hơn hoặc mô tả đặc điểm của đoạn chèn, các khuẩn lạc được biến nạp phải được phân tích sâu hơn, vì kết quả sàng lọc xanh trắng và sàng lọc dương tính chỉ có thể cung cấp thông tin về việc có chèn hay không. Một cách tiếp cận cơ bản là thực hiện cắt giới hạn các plasmid tách được từ ​​các khuẩn lạc dương tính hoặc khuẩn lạc trắng và kiểm tra kết quả bằng điện di gel. Các enzyme giới hạn phải được lựa chọn cẩn thận và có thể được sử dụng để xác nhận kích thước và hướng của vật chèn.

Sự hiện diện của đoạn chèn cũng có thể được xác định bằng một phương pháp gọi là PCR khuẩn lạc, trong đó một phần nhỏ các khuẩn lạc được phân tích bằng PCR. Phương pháp này đòi hỏi các đoạn mồi PCR dành riêng cho phần chèn, cho vùng vecto kẹp hai bên đoạn chèn hoặc cả hai, để phát hiện phần chèn. Để xác định hướng của phần chèn, các cặp mồi gồm một mồi bám vào vector và một mồi bám đoạn chèn có thể được thiết kế (Hình 8).

Cách chắc chắn nhất để xác định đúng đoạn chèn là giải trình tự Sanger (còn được gọi là giải trình tự dideoxy). Mặc dù đây là một cách tốt để xác nhận sự hiện diện và trình tự chính xác của phần chèn, phương pháp này có thể tốn thời gian và chi phí, tùy thuộc vào số lượng khuẩn lạc được sàng lọc.

Khi các bản sao với đoạn chèn chính xác được xác định, chúng đã sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Tất cả hình ảnh minh họa trong bài viết thuộc về thermofisher.com

iceberg (biên tập)

tapchisinhhoc.com

Đọc thêm

13 phương pháp chuyển gen phổ biến
PCR – 6 thành phần quan trọng cần hiểu cho đúng