Hình 1: Quy trình qPCR (Nguồn: Bio-Rad)
Nội dung
qPCR là gì?
PCR thời gian thực (Real-time PCR) hay còn gọi là PCR định lượng (qPCR) sử dụng điều kiện khuếch đại ADN tương tự như PCR thông thường nhưng có khả năng phát hiện sản phẩm PCR trong thời gian thực mà không cần điện di trên gel agarose cũng như định lượng lượng ADN trong mẫu.
Kỹ thuật phát hiện và khuếch đại axit nucleic là một trong những công cụ có giá trị nhất trong nghiên cứu sinh học hiện nay. Các nhà khoa học trong mọi lĩnh vực khoa học đời sống — nghiên cứu cơ bản, công nghệ sinh học, y học, pháp y, chẩn đoán, v.v. — sử dụng các phương pháp này trong nhiều ứng dụng.
Đối với một số ứng dụng, việc phát hiện axit nucleic định tính là đủ. Tuy nhiên, các ứng dụng khác yêu cầu phân tích định lượng.
PCR thời gian thực (qPCR) có thể được sử dụng cho cả phân tích định tính và định lượng; việc chọn phương pháp tốt nhất cho ứng dụng của bạn đòi hỏi kiến thức sâu rộng về công nghệ này.
Trong PCR thông thường, sản phẩm ADN khuếch đại hoặc khuếch đại được phát hiện trong phân tích điểm cuối. Trong PCR thời gian thực, sự tích lũy sản phẩm khuếch đại được đo khi phản ứng diễn ra theo thời gian thực với việc định lượng sản phẩm sau mỗi chu kỳ.
Quy trình làm việc qPCR như trên hình 1 mô tả các bước trong PCR thời gian thực:
- Đầu tiên, các phản ứng khuếch đại được thiết lập bằng thuốc thử PCR và các mồi đặc biệt hoặc tùy chỉnh.
- Sau đó, các phản ứng sẽ được chạy trong các thiết bị PCR thời gian thực và dữ liệu thu thập được sẽ được phân tích bằng phần mềm thiết bị độc quyền.
Việc phát hiện các sản phẩm PCR theo thời gian thực được thực hiện bằng cách đưa phân tử gắn huỳnh quang vào mỗi giếng phản ứng giúp tăng cường huỳnh quang với lượng ADN sản phẩm ngày càng tăng. Các chất hóa học phát huỳnh quang được sử dụng cho mục đích này bao gồm thuốc nhuộm gắn ADN và mồi hoặc mẫu dò đặc hiệu theo trình tự được đánh dấu bằng huỳnh quang.
Máy gia nhiệt chuyên dụng được trang bị mô-đun phát hiện huỳnh quang được sử dụng để theo dõi tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại diễn ra.
Độ huỳnh quang đo được tỷ lệ thuận với tổng lượng khuếch đại; sự thay đổi huỳnh quang theo thời gian được sử dụng để tính toán lượng khuếch đại được tạo ra trong mỗi chu kỳ.
Nguyên lý hoạt động của qPCR
Để hiểu cách hoạt động của PCR thời gian thực, chúng tôi minh họa phân tích qPCR bằng cách sử dụng biểu đồ khuếch đại điển hình (Hình 2). Trong biểu đồ này, số chu kỳ PCR được hiển thị trên trục x và huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống, được hiển thị trên trục y.
Hình 2: Sơ đồ khuếch đại (Nguồn: Bio-Rad)
Biểu đồ khuếch đại cho thấy hai pha, một pha theo cấp số nhân, sau đó là một pha ổn định không theo cấp số nhân. Trong giai đoạn hàm mũ, lượng sản phẩm PCR tăng gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra, các thành phần phản ứng bị tiêu hao và cuối cùng một hoặc nhiều thành phần trở nên hạn chế. Tại thời điểm này, phản ứng chậm lại và bước vào giai đoạn ổn định (chu kỳ 28–40 trong Hình 2).
Ban đầu, huỳnh quang vẫn ở mức nền và không thể phát hiện được sự gia tăng huỳnh quang (chu kỳ 1–18, Hình 2) mặc dù sản phẩm tích lũy theo cấp số nhân. Cuối cùng, sản phẩm được khuếch đại sẽ tích lũy đủ để tạo ra tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được.
Số chu kỳ mà điều này xảy ra được gọi là chu trình định lượng, hay Cq. Do giá trị Cq được đo ở pha hàm mũ khi thuốc thử không bị giới hạn, qPCR thời gian thực có thể được sử dụng để tính toán chính xác và đáng tin cậy lượng mẫu ban đầu có trong phản ứng dựa trên hàm mũ đã biết mô tả tiến trình phản ứng.
Cq của phản ứng được xác định chủ yếu bởi lượng khuôn có mặt khi bắt đầu phản ứng khuếch đại.
Nếu có một lượng lớn khuôn mẫu khi bắt đầu phản ứng thì sẽ cần tương đối ít chu kỳ khuếch đại để tích lũy đủ sản phẩm nhằm tạo ra tín hiệu huỳnh quang trên nền. Do đó, phản ứng sẽ có Cq thấp hoặc sớm.
Ngược lại, nếu có một lượng nhỏ mẫu khi bắt đầu phản ứng thì sẽ cần nhiều chu kỳ khuếch đại hơn để tín hiệu huỳnh quang vượt lên trên nền. Do đó, phản ứng sẽ có Cq cao hoặc muộn. Mối quan hệ này tạo cơ sở cho khía cạnh định lượng của PCR thời gian thực.
Ưu điểm của PCR thời gian thực (qPCR)
Ưu điểm chính của PCR thời gian thực so với PCR là qPCR cho phép bạn xác định số lượng bản sao ADN mẫu ban đầu (chuỗi mục tiêu khuếch đại) với độ chính xác và độ nhạy cao trên phạm vi động rộng.
Kết quả qPCR có thể là định tính (có hoặc không có trình tự) hoặc định lượng (số bản sao). Do đó, PCR thời gian thực định lượng còn được gọi là phân tích qPCR.
Ngược lại, PCR tốt nhất là bán định lượng.
Ngoài ra, dữ liệu qPCR thời gian thực có thể được đánh giá mà không cần điện di trên gel, giúp giảm thời gian xét nghiệm và tăng công suất. Cuối cùng, do các phản ứng qPCR thời gian thực được chạy và dữ liệu được đánh giá trong hệ thống qPCR ống kín, thống nhất nên khả năng lây nhiễm sẽ giảm và nhu cầu thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ trong phân tích qPCR.
PCR so với qPCR
Hầu hết các ứng dụng của phản ứng chuỗi polymerase đều tập trung vào mục đích cơ bản là cách biến một lượng nhỏ ADN thành lượng ADN lớn hơn. Điều này là cần thiết cho điện di trên gel và hầu hết các hình thức giải trình tự ADN.
Tuy nhiên, nó cũng hạn chế khả năng cung cấp thông tin của PCR. Nó thường được coi là một bước trong một phép đo khác chứ không phải là một công cụ riêng lẻ.
PCR định lượng (qPCR) bổ sung thêm hai yếu tố vào quy trình PCR tiêu chuẩn:
- Thuốc nhuộm huỳnh quang
- Máy đo huỳnh quang
Hai yếu tố này biến qPCR từ một bước xử lý trong một quy trình khác – thành một kỹ thuật đo lường theo đúng nghĩa của nó.
Máy chu trình nhiệt được sử dụng với qPCR bao gồm máy đo huỳnh quang để phát hiện huỳnh quang đó.
Máy đo huỳnh quang phát hiện huỳnh quang đó trong thời gian thực khi máy quay vòng nhiệt chạy, đưa ra các kết quả đọc trong suốt quá trình khuếch đại PCR.
Do đó, PCR định lượng còn được gọi là PCR thời gian thực hoặc Real-tim PCR (RT-PCR).
Kết hợp với các đường cong tiêu chuẩn và giá trị tham chiếu thích hợp, thông tin thời gian thực này về tốc độ và thời gian phản ứng sẽ chuyển thành thông tin về lượng DNA tương đối và tuyệt đối hiện diện.
Ứng dụng qPCR
Các xét nghiệm PCR/qPCR thời gian thực đã trở thành công cụ được lựa chọn để xác định và định lượng nhanh chóng và nhạy cảm axit nucleic trong các mẫu sinh học khác nhau, với các ứng dụng đa dạng như phân tích biểu hiện gen, phát hiện sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm và kiểu hình ung thư (cancer phenotyping).
Trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu, xét nghiệm qPCR được sử dụng rộng rãi để đo định lượng số lượng bản sao gen (liều lượng gen) trong các dòng tế bào biến nạp hoặc sự hiện diện của gen đột biến.
Kết hợp với PCR phiên mã ngược (RT-PCR), xét nghiệm qPCR có thể được sử dụng để định lượng chính xác những thay đổi trong biểu hiện gen, ví dụ: tăng hoặc giảm biểu hiện để đáp ứng với các điều kiện môi trường hoặc điều trị bằng thuốc khác nhau, bằng cách đo lường những thay đổi trong tế bào. mức độ mARN.
Biểu hiện gen với qPCR
Một trong những điểm mạnh hàng đầu của qPCR là khả năng đo biểu hiện gen.
Biểu hiện gen, hay tổng hợp mRNA, là một phần quan trọng của quá trình tổng hợp protein.
Biểu hiện gen là một lĩnh vực đang được các nhà sinh học phân tử nghiên cứu tích cực – giúp hiểu được nhiều con đường sinh học và bệnh tật. Bằng cách sử dụng enzyme phiên mã ngược, nhà nghiên cứu tạo ra các bản sao DNA (cDNA) bổ sung của ARN trong mẫu của họ, sau đó thực hiện qPCR với cDNA đó.
Quá trình này được gọi là phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (reverse-transcription PCR).
Kết quả đọc được cung cấp thông tin về lượng mRNA khó đo lường có trong mẫu ban đầu, không được phiên mã ngược.
Loại dữ liệu được tạo ra trong quá trình chạy qPCR phụ thuộc rất nhiều vào mồi và thuốc nhuộm được sử dụng.
Thông thường, một qPCR duy nhất thu thập dữ liệu về một gen duy nhất, vì thuốc nhuộm được sử dụng trong qPCR thường không đặc hiệu và sẽ hợp nhất nhiều gen thành một lần đọc nếu sử dụng nhiều mồi trong cùng một hỗn hợp. Tuy nhiên, với đầu dò ADN huỳnh quang thay vì thuốc nhuộm, có thể “ghép kênh” qPCR và đo nhiều mục tiêu ADN, miễn là đầu dò tương ứng của mỗi mục tiêu phát huỳnh quang ở tần số khác nhau.
(*) Theo Bio-Rad, ThermoFisher Scientific
