PCR – 6 thành phần quan trọng cần hiểu cho đúng

thành phần phản ứng pcr

Khuôn DNA

Khuôn cho PCR có thể là bất kỳ nguồn DNA nào, chẳng hạn như DNA hệ gen (gDNA), cDNA và DNA plasmid. Tuy nhiên, thành phần hoặc độ phức tạp của DNA cũng quy định lượng đầu vào tối ưu cho phản ứng PCR. Ví dụ, 0.1–1 ng DNA plasmid là đủ, trong khi 5–50 ng gDNA có thể mới đủ làm  lượng đầu vào cho một phản ứng 50 ul. Lượng khuôn tối ưu cũng có thể thay đổi dựa trên loại DNA polymerase được sử dụng; một DNA polymerase được cải tiến để có độ nhạy cao hơn do ái lực cao với mẫu sẽ yêu cầu DNA đầu vào ít hơn. Tối ưu hóa đầu vào DNA rất quan trọng vì số lượng cao hơn làm tăng nguy cơ khuếch đại không đặc hiệu trong khi lượng thấp hơn làm giảm lượng sản phẩm (Hình 1).

Đôi khi, các quy trình PCR có thể yêu cầu đầu vào DNA theo đơn bị số bản sao, đặc biệt là đối với gDNA. Việc tính toán số lượng bản sao phụ thuộc vào số lượng phân tử có trong số mol đầu vào DNA. Sử dụng hằng số Avogadro, (L) và khối lượng mol, số lượng bản sao có thể được tính như sau:

Sao bản sao = L x số mol = L x (tổng khối lượng / khối lượng mol)

Khối lượng mol của một đoạn DNA cụ thể được xác định bởi kích thước hoặc tổng số lượng bazơ của nó. Để thuận tiện và đơn giản, một công cụ trực tuyến có sẵn cho phép tính số lượng bản sao từ khối lượng DNA đầu vào.

Về lý thuyết, một bản sao DNA hoặc một tế bào duy nhất là đủ để khuếch đại bằng PCR trong điều kiện lý tưởng. Tuy nhiên, trong thực tế, hiệu quả khuếch đại của một lượng mẫu cụ thể phụ thuộc nhiều vào các thành phần và thông số phản ứng, cũng như độ nhạy của DNA polymerase.

Bên cạnh gDNA, cDNA và DNA plasmid, cũng có thể khuếch đại lại các sản phẩm PCR để thu được lượng sản phẩm cao hơn. Mặc dù các sản phẩm chưa được tính sạch có thể được sử dụng trực tiếp làm khuôn, các thành phần phản ứng chuyển tiếp như mồi, dNTP, muối và sản phẩm phụ có thể ảnh hưởng xấu đến lần khuếch đại tiếp theo. Để tránh sự ức chế như vậy, một khuyến nghị chung là pha loãng sản phẩm trong nước trước vòng PCR tiếp theo. Để có kết quả tốt nhất, sản phẩm PCR nên được tinh sạch trước khi khuếch đại vòng tiếp theo. Với các bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR được tối ưu hóa, quy trình làm sạch PCR có thể được thực hiện trong thời gian tối thiểu, 5 phút.

DNA polymerase

DNA polymerase là yếu tố quan trọng trong việc sao chép DNA đích. Taq DNA polymerase được cho là enzyme nổi tiếng nhất được sử dụng cho PCR, sự phát kiến về nó đã cách mạng hóa việc PCR. Taq DNA polymerase có mức độ ổn định nhiệt tương đối cao, với chu kỳ bán hủy khoảng 40 phút ở 95°C [1]. Nó trùng hợp các nucleotide với tốc độ khoảng 60 bazơ mỗi giây ở 70°C và có thể khuếch đại độ dài khoảng 5 kb, vì vậy nó phù hợp với PCR điển hình mà không cần các yêu cầu đặc biệt. Ngày nay, các thế hệ DNA polymerase mới đã được thiết kế để cải thiện hiệu suất PCR.

Trong một phản ứng 50 uL điển hình, 1 -2 unit DNA polymerase là đủ để khuếch đại DNA đích. Tuy nhiên, có thể cần phải điều chỉnh lượng enzyme cho các mẫu khó. Ví dụ, khi các chất ức chế có mặt trong mẫu DNA, việc tăng lượng DNA polymerase có thể cải thiện phản ứng PCR. Tuy nhiên, các sản phẩm PCR không đặc hiệu có thể xuất hiện nếu dùng nồng độ enzyme cao hơn (Hình 2).

Đối với các ứng dụng chuyên biệt hơn như PCR tách dòng, khuếch đại dài và PCR giàu GC, DNA polymerase với hiệu suất cao hơn cần được ưu tiên dùng. Các enzyme này có khả năng tạo ra các sản phẩm PCR có sai sót thấp hơn từ các khuôn rất dài trong thời gian ngắn hơn với năng suất tốt hơn và khả năng chống lại các chất ức chế cao hơn (tìm hiểu thêm về các đặc tính DNA polymerase).

Mồi

Mồi PCR là các oligonucleotide DNA tổng hợp dài khoảng 15 – 30 base. Các mồi PCR được thiết kế để liên kết (thông qua bổ sung trình tự) với các trình tự bên cạnh khu vực quan tâm trong khuôn DNA. Trong quá trình PCR, DNA polymerase kéo dài các đoạn mồi từ đầu 3’. Do đó, các vị trí bám của mồi phải là duy nhất đối với vùng lân cận của mục tiêu và có sự tương đồng tối thiểu (càng ít càng tốt) với các đoạn khác trong DNA đầu vào để đảm bảo khuếch đại đặc hiệu.

Ngoài tương đồng trình tự, các mồi phải được thiết kế cẩn thận theo các cách khác để có tính đặc hiệu cho PCR. Đầu tiên, các trình tự mồi phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) trong khoảng 55 – 70°C, với Tm của hai mồi chênh nhau không quá 5°C. Quan trọng không kém, các đoạn mồi phải được thiết kế không có sự bổ sung với nhau (đặc biệt là ở đầu 3 ‘) đế tránh mồi tự gắn với nhau (tạo thành primer – dimer), và cũng không tự bổ sung (có thể tạo cấu trúc bậc hai) hoặc lặp lại ngược chiều có thể tạo ra sự gắn không hoàn hảo với mục tiêu.

Hơn nữa, hàm lượng GC của mồi lý tưởng nên là 40 – 60%, với sự phân bố đồng đều các C và G để tránh sự gắn mồi sai. Tương tự, không nên có nhiều hơn ba base G hoặc C ở đầu 3′ của các mồi, để giảm thiểu mồi không đặc hiệu. Mặt khác, một nucleotide C hoặc G ở đầu 3’ của một mồi có thể thúc đẩy sự bám và kéo dài (Bảng 1). Để thuận tiện và đơn giản, một số công cụ trực tuyến có sẵn cho phép chọn trình tự mồi tối ưu với các tham số đã xác định.

Bảng 1. Những lời khuyên cho thiết kế mồi PCR

Nên	Tránh
– 15–30 nt – Tm 55–70°C (hai mồi cách nhau không quá 5oC) – 40–60% GC ( phân bố đồng đều trên mồi) – Một C hoặc G ở đầu 3’	– Cấu trúc bậc hai – Các trình tự lặp ngược chiều – Nhiều hơn 3 G hoặc C ở đầu 3’

Khi thiết kế phản ứng PCR, các mồi được thêm vào phản ứng trong phạm vi 0,1 – 1M. Đối với các mồi có các base thoái hóa hoặc được sử dụng trong long PCR, nồng độ mồi 0,3 – 1 uM thường thuận lợi. Một khuyến nghị chung là bắt đầu với nồng độ tiêu chuẩn và điều chỉnh khi cần thiết. Nồng độ mồi cao hơn thường dễ gây gắn mồi sai và khuếch đại không đặc hiệu. Mặt khác, nồng độ mồi thấp có thể dẫn đến khuếch đại kém hoặc không khuếch đại được trình tự mong muốn (Hình 3).

Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)

dNTP bao gồm bốn nucleotide cơ bản, dATP, dCTP, dGTP và dTTP, là các đơn vị cấu tạo của chuỗi DNA mới. Bốn nucleotide này thường được thêm vào phản ứng PCR với số lượng bằng nhau để trùng hợp các base tối ưu. Tuy nhiên, trong một số tình huống như gây đột biến ngẫu nhiên bằng PCR, nồng độ dNTP không cân bằng có chủ ý sẽ gây ra tỉ lệ sai sót cao hơn nếu sử dụng DNA polymerase không có hoạt tính đọc sửa.

Trong các ứng dụng PCR thông thường, nồng độ cuối cùng của mỗi dNTP thường là 0,2 mM. Nồng độ cao hơn có thể giúp ích trong một số trường hợp, đặc biệt là khi có nồng độ Mg2+ cao, vì Mg2+ liên kết với dNTP và làm giảm khả năng kết hợp của chúng. Tuy nhiên, dNTPs vượt quá nồng độ tối ưu có thể ức chế PCR. Để kết hợp hiệu quả với DNA polymerase, các dNTP tự do phải có mặt trong phản ứng ở nồng độ không dưới 0,010 – 0,015 mM (Hình 4). Khi sử dụng các DNA polymerase không đọc sửa, độ chính xác có thể được cải thiện bằng cách hạ thấp nồng độ dNTP (0,01 – 0,05 mM), cũng như giảm tỷ lệ Mg²⁺.

Trong một số ứng dụng, các dNTP có thể là các nucleotide đặc biệt. Một ví dụ là thay thế dTTP bằng deoxyuridine triphosphate (dUTP), kết hợp với uracil DNA glycosylase (UDG), như một cáhc để ngăn ngừa nhiễm carryover [2]. UDG là một enzyme sửa chữa DNA cắt các chuỗi DNA có chứa uracil. Thay thế dTTP bằng dUTP tạo ra các sản phẩm PCR có chứa uracil. Ủ các mẫu phản ứng với UDG trước khi bắt đầu PCR sẽ ngăn chặn sự khuếch đại các sản phẩm PCR trước đó (chứa uracil) nếu có nhiễm , do đó ngăn ngừa kết quả dương tính giả từ các sản phẩm PCR chuyển tiếp (Hình 5) .

Có một vài lưu ý khi xem xét sử dụng dUTP trong PCR. Đầu tiên, thay thế dUTP có thể làm giảm hiệu quả và độ nhạy của PCR. Thách thức này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng tỷ lệ tối ưu của dTTP so với dUTP sao cho mỗi sản phẩm PCR mang đủ số base uracil để được xử lý một cách hiệu quả với UDG mà không ảnh hưởng đáng kể vào hiệu quả PCR. Thứ hai, mặc dù Taq DNA polymerase có trùng hợp dUTP trong quá trình tổng hợp DNA, nhưng các DNA polymerase có hoạt tính đọc sửa như Pfu không thể dung nạp dUTP trừ khi chúng được biến đổi đặc biệt để kết hợp uracil. Đặc tính này là do sự hiện diện của tiểu phần liên kết uracil trong DNA polymerase của vi khuẩn cổ chịu nhiệt như một cơ chế sửa chữa DNA [3,4].

Tương tự, các dNTP bị biến đổi như aminoallyl-dUTP, fluorescein-12-dUTP, 5-bromo-dUTP và biotin-11-dUTP thường được sử dụng để đánh dấu cho các thử nghiệm tiếp theo. Tương tự như dUTP, DNA polymerase phải có khả năng trùng hợp các dNTP biến đổi để PCR thành công.

Ion magiê (Mg2+)

Ion magiê (Mg2+) hoạt động như một cofactor cho hoạt động của các DNA polymerase bằng cách cho phép gắn các dNTP trong quá trình trùng hợp. Các ion magiê tại vị trí hoạt động của enzyme xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester giữa 3′-OH của một mồi và nhóm phosphate của một dNTP (Hình 6). Ngoài ra, Mg2+ tạo điều kiện cho sự hình thành phức hệ giữa mồi và khuôn DNA bằng cách ổn định điện tích âm trên bộ khung phosphate của chúng (Hình 8) [5].

Các ion Mg2+ thường được phân phối dưới dạng dung dịch MgCl2 vào hỗn hợp PCR. Tuy nhiên, một số polymerase như Pfu DNA polymerase thích MgSO4, vì sulfate giúp đảm bảo hiệu suất mạnh hơn và có thể thực hiện lặp lại trong một số trường hợp nhất định. Nồng độ magiê thường cần tối ưu để tối đa hóa hiệu suất PCR trong khi vẫn duy trì tính đặc hiệu do liên kết với dNTP, mồi, khuôn DNA và EDTA (nếu có).

Nồng độ cuối cùng cho Mg2 + trong PCR thường nằm trong khoảng 1 – 4 mM, với mức tăng 0,5 mM từng nấc một được khuyến nghị để tối ưu hóa. Nồng độ Mg2+ thấp dẫn đến ít hoặc không có sản phẩm PCR, do hoạt tính polymerase giảm. Mặt khác, nồng độ Mg2+ cao thường tạo ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu do sự ổn định của phức hợp mẫu mồi được nâng cao, cũng như làm tăng các lỗi sao chép do sự trùng hợp dNTPs không chính xác (Hình 7).

Đệm

PCR được thực hiện trong một đệm cung cấp môi trường hóa học phù hợp cho hoạt động của DNA polymerase. Độ pH của đệm thường nằm trong khoảng từ 8,0 đến 9,5 và thường được ổn định bởi Tris-HCl.

Đối với Taq DNA polymerase, một thành phần phổ biến trong bộ đệm là ion kali (K +) từ KCl, giúp thúc đẩy quá trình gắn mồi. Đôi khi, ammonium sulfate (NH4)2SO4 có thể thay thế KCl trong dung dịch đệm. Ion amoni (NH4+) có tác dụng làm mất ổn định, đặc biệt là liên kết hydro yếu giữa base bắt cặp sai vào khuôn, do đó tăng cường tính đặc hiệu (Hình 8).

Do Mg²⁺ có tác dụng ổn định tương tự K⁺, nên nồng độ MgCl2 được khuyến nghị thường thấp hơn khi sử dụng đệm KCl (1,5 ± 0,25 mM) nhưng cao hơn với đệm (NH4) SO4 (2,0 ± 0,5 mM). Do tác dụng đối kháng của NH4+ và Mg2+, các chất đệm có (NH4)2SO4 cung cấp độ đặc hiệu mồi cao hơn trong phạm vi nồng độ Mg2+  rộng hơn (Hình 9). Điều quan trọng là phải tuân theo các khuyến nghị về bộ đệm của nhà cung cấp enzyme, vì bộ đệm PCR tối ưu phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng.

Trong một số trường hợp nhất định, các chất phụ gia hóa học có thể được đưa vào bộ đệm để cải thiện độ đặc hiệu khuếch đại bằng cách giảm sự gắn mồi sai và để tăng cường hiệu quả khuếch đại bằng cách loại bỏ các cấu trúc thứ cấp (Bảng 2). Ngoài ra, một số DNA polymerase được cung cấp với các chất tăng cường có công thức đặc biệt được tối ưu hóa cho bộ đệm DNA polymerase và PCR. Các hóa chất này thường được sử dụng với các khuôn khó như khuôn giàu GC. Lưu ý rằng việc sử dụng các chất phụ gia hóa học có thể ảnh hưởng đến quá trình gắn mồi, biến tính khuôn, liên kết với Mg2+ cũng như hoạt động của enzyme. Ngoài ra, chúng có thể can thiệp vào một số ứng dụng nhất định sau PCR. Do đó, điều quan trọng là phải nhận thức được các thành phần đệm để sử dụng thành công PCR và ứng dụng về sau.

Bảng 2. Các chất phụ gia phổ biến được dùng để cải thiện PCR, và nồng độ khuyến nghị của chúng

Hóa chất	Nồng độ cuối cùng
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	1–10%
Glycerol	5–20%
Formamide	1.25–10%
Bovine serum albumin (BSA)	10–100 µg/mL
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	15–30 mM
Polyethylene glycol (PEG)	5–15%
Gelatin	0.01%
Nonionic detergents (e.g., Tween 20, Triton X-100)	0.05–01%
N,N,N-trimethylglycine (betaine)	1–3 M

 

Nguồn tham khảo

1. Pelt-Verkuil EV, Belkum AV, Hays JP (2008) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. Dordrecht: Springer.
2. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93(1):125–128.
3. Slupphaug G, Alseth I, Eftedal I et al. (1993) Low incorporation of dUMP by some thermostable DNA polymerases may limit their use in PCR amplifications. Anal Biochem 211(1):164–169.
4. Lasken RS, Schuster DM, Rashtchian A (1996) Archaebacterial DNA polymerases tightly bind uracil-containing DNA. J Biol Chem 271(30): 17692–17696.
5. Steitz TA (1998) A mechanism for all polymerases. Nature 391(6664):231–232.
6. Bartlett JMS, Stirling D (2003) PCR Protocols. In: Methods in molecular biology (2nd ed). Totowa: Humana Press.  

Bài viết được tham khảo từ trang web của Công ty phát triển sản phẩm công nghệ sinh học Thermo Fisher Scientific. Các ảnh ở đây đều thuộc về trang web này.

Xem thêm: Mẹo PCR khuếch đại các trình tự khó

Các kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới

Làm sao để hạn chế bị nhiễm trong PCR

 

tapchisinhhoc.com