Nội dung
Sơ lược các phương pháp tinh sạch protein
Sự cần thiết của tinh sạch protein
Một phần quan trọng của nghiên cứu công nghệ sinh học là sử dụng các kỹ thuật kỹ nghệ protein để thiết kế hoặc cải biến protein với các đặc tính tối ưu hóa cho các ứng dụng công nghiệp cụ thể. Để làm điều này, các nhà khoa học phải có khả năng thu tách và tinh sạch protein quan tâm để có thể nghiên cứu cấu hình, sự đặc hiệu cơ chất, các phản ứng với các phối tử khác và các hoạt tính nhất định.
Không giống như nghiên cứu với DNA, không có quy trình hướng dẫn chuẩn mực hay “công thức” sẵn có cho biết một cách tiếp cận áp dụng được cho tất cả các protein. Mỗi bước tinh chế protein thường dẫn đến một mức độ hao hụt sản phẩm. Do đó, một quy trình tinh chế protein lý tưởng là một quy trình trong đó mức độ tinh khiết đạt được cao nhất trong ít bước nhất.
Mức độ tinh khiết của protein được yêu cầu phụ thuộc vào mục đích sử dụng của protein. Đối với một số ứng dụng, chúng ta chỉ cần dừng ở dịch chiết thô là đủ. Tuy nhiên, đối với các mục đích khác, như trong thực phẩm và dược phẩm, thì cần có độ tinh khiết cao.
Phân lập và tinh chế một protein từ các tế bào chứa hỗn hợp hàng ngàn protein không liên quan là có thể đạt được nhờ vào các đặc tính vật lý và hóa học của protein. Đặc điểm đặc trưng cho mỗi protein là thành phần, trình tự axit amin, cấu trúc tiểu đơn vị, kích thước, hình dạng, điện tích, điểm đẳng điện, độ hòa tan, độ ổn định nhiệt, tính kỵ nước, các đặc tính liên kết phối tử /kim loại và sửa đổi sau dịch mã có thể được khai thác trong quá trình tinh sạch. Dựa trên những tính chất này một sự kết hợp của nhiều phương pháp, được liệt kê dưới đây, có thể được sử dụng để thu protein từ tế bào.
Tinh sạch protein là một công việc quan trọng cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn ứng dụng, song lại không có những quy trình chung cho tất cả các loại protein.
Các phương pháp tinh sạch protein phổ biến
Nói chung, tinh chế protein đòi hỏi cơ bản năm bước:
1) thu dịch thô từ vật liệu sinh học;
2) tách protein khỏi các thành phần phi protein (nucleic axit và lipit);
3) các bước kết tủa, ban đầu để thu hồi protein số lượng lớn từ dịch chiết , tiếp theo là tách sơ bộ thành các phân đoạn có thể;
4) sử dụng sắc ký trao đổi ion/phân đoạn kích thước hoặc sắc ký kỵ nước để tiếp tục tách phần chứa protein đích khỏi hỗn hợp protein;
5) thêm một số công đoạn tinh sạch như sử dụng sắc ký ái lực để thu protein đích ở trạng thái tinh khiết cao.
Các phương pháp phổ biến nhất dùng trong tinh sạch protein bao gồm:
| Phương pháp tách chiết | Cơ sở |
| 1. Kết tủa Ammonium sulfate [1] | Tính tan Tính tan |
| 2. Sắc ký Trao đổi ion Tương tác kỵ nước Ái lực kim loại Ái lực phổi tử Lọc gel | Độ tích điện Tính kị nước bề mặt Có vị trí bám kim loại Có vị trí bám phổi tử (NAD, NADP …) Hình dạng, kích thước |
| 3. Ly tâm | Hình dạng, kích thước |
Tinh sạch protein dựa vào các khác biệt đặc trưng của protein quan tâm, ví dụ tính tan, độ tích điện, hình dạng, kích thước …
Các bước đầu tiên
Bước đầu tiên trong việc tinh sạch protein nội bào (bên trong tế bào) là chuẩn bị hỗn hợp dịch chiết thô. Dịch chiết sẽ chứa một hỗn hợp phức tạp của tất cả các protein từ tế bào chất của tế bào và một số đại phân tử, các cofacter (nhóm ngoại của enzyme) cũng như các chất dinh dưỡng. Dịch chiết thô có thể được sử dụng cho một số ứng dụng trong công nghệ sinh học, tuy nhiên, nếu độ tinh sạch là yếu tố cần thiết, các bước tinh sạch tiếp theo phải được thực hiện. Dịch chiết protein thô được xử lý tiếp trong công đoạn loại bỏ các mảnh vụn của tế bào tạo ra bởi quá trình ly giải tế bào, việc này đạt được bằng cách sử dụng các hóa chất và enzyme, hoặc siêu âm.
Các mảnh vỡ được loại bỏ bằng cách ly tâm, và phần nổi phía trên được thu lại. Các chế phẩm thô của protein ngoại bào có thể thu được bằng cách ly tâm loại bỏ tế bào, bỏ qua bước phá vỡ tế bào.
Đối với các ứng dụng công nghệ sinh học nhất định, có nhu cầu về các enzyme ổn nhiệt, tức là các enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao mà không bị biến tính trong khi vẫn duy trì hoạt tính cao. Một cách dễ dàng để tinh sạch protein chịu nhiệt là làm biến tính các protein khác trong hỗn hợp bằng cách đun nóng, sau đó làm lạnh dung dịch (do đó cho phép enzyme bền nhiệt có thể phục hồi hoặc hòa tan trở lại, nếu cần). Các protein bị biến tính sau đó có thể được loại bỏ bằng cách ly tâm.
Thông thường những việc đầu tiên là thu dịch chiết thô từ sinh vật, loại bỏ những phần cặn như xác tế bào.
Các bước tinh chế trung gian
Trước đây, bước thứ hai phổ biến để tinh chế protein từ dịch chiết thô là kết tủa trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao (ví dụ như dung dịch muối). Các axit nucleic trong dịch chiết thô có thể được loại bỏ bằng cách kết tủa các phức hợp được hình thành với streptomycin sulfate hoặc protamine sulfate. Kết tủa protein thường được thực hiện bằng cách sử dụng ammonium sulfate.
Ví dụ về kết tủa protein bằng PEG. Ảnh: Hyejin KangJiyoon KimJaesung Park/Springer
Các protein khác nhau sẽ kết tủa ở nồng độ ammonium sulfate khác nhau. Nói chung, protein có trọng lượng phân tử cao hơn kết tủa ở nồng độ ammonium sulfate thấp hơn. Kết tủa muối thường không thu được protein tinh khiết cao nhưng có thể hỗ trợ loại bỏ một số protein không mong muốn trong hỗn hợp và cô đặc mẫu. Các muối trong dung dịch sau đó được loại bỏ bằng thẩm tách qua ống cellulose xốp, lọc hoặc sắc ký lọc gel.
Các phương pháp công nghệ sinh học hiện đại thường tận dụng lợi thế của nhiều bộ kit thương mại cung cấp các quy trình chuẩn. Tinh sạch protein thường được thực hiện bằng cách sử dụng các bộ lọc và cột lọc gel đã được chuẩn bị. Tất cả những gì bạn phải làm là làm theo hướng dẫn, thêm đúng thể tích của dung dịch và đợi khoảng thời gian quy định để thu được dịch chảy qua.
Phương pháp sắc ký có thể được áp dụng bằng các cột hoặc thiết bị HPLC tự động. Việc phân tách bằng HPLC có thể được thực hiện bằng các phương pháp ngược pha, trao đổi ion hoặc lọc bằng kích thước và các mẫu được phát hiện bởi công nghệ diode hoặc laser.
Trực quan hóa và đánh giá tinh sạch
Sắc ký ngược pha (RPC) phân tách protein dựa trên tính kỵ nước của chúng. Kỹ thuật này có tính chọn lọc cao nhưng yêu cầu sử dụng dung môi hữu cơ. Một số protein bị biến tính vĩnh viễn bởi dung môi và sẽ mất chức năng trong RPC. Do đó, phương pháp này không được khuyến nghị cho tất cả các ứng dụng, đặc biệt khi protein quan tâm cần giữ được hoạt tính của nó.
Sắc ký trao đổi ion là cách tách protein dựa trên điện tích. Cột có thể được thiết kế để trao đổi anion hoặc trao đổi cation. Các cột trao đổi anion chứa một pha đứng yên với điện tích dương thu hút các protein tích điện âm. Các cột trao đổi cation là các hạt tích điện âm, thu hút các protein tích điện dương. Việc thu hồi protein đích được thực hiện bằng cách thay đổi độ pH trong cột, dẫn đến thay đổi hoặc trung hòa các nhóm chức tích điện của mỗi protein.
Sắc ký loại trừ kích thước (còn được gọi là lọc gel) tách protein lớn khỏi các nhỏ do các phân tử lớn di chuyển qua polyme liên kết ngang trong cột sắc ký nhanh hơn. Các protein lớn không vừa với các lỗ của polymer trong khi các protein nhỏ hơn thì mất nhiều thời gian hơn để đi qua cột sắc ký, thông qua con đường vòng vèo hơn. Dịch chảy qua được thu thập trong một loạt các ống protein qua thời gian tách rửa. Lọc gel là một công cụ hữu ích để cô đặc một mẫu protein vì protein mục tiêu được thu thập trong một thể tích tách rửa nhỏ hơn so với thể tích ban đầu được cho vào cột.
Các kỹ thuật lọc tương tự có thể được sử dụng trong quá trình sản xuất protein quy mô lớn vì hiệu quả chi phí của chúng.
Hình ảnh minh họa bốn phương pháp sắc ký tinh sạch protein.
Sắc ký ái lực là một kỹ thuật rất hữu ích để “làm sáng” hay hoàn thành quá trình tinh chế protein. Các hạt trong cột sắc ký được liên kết với các phối tử đặc hiệu của protein mong muốn. Protein sau đó được loại bỏ khỏi cột bằng cách rửa sạch bằng dung dịch chứa các phối tử tự do. Phương pháp này cho kết quả tinh khiết nhất và hoạt động đặc thù nhất so với các kỹ thuật khác.
SDS-PAGE là điện di trên gel polyacrylamide, được thực hiện với sự có mặt của SDS (natri dodecyl sulfate) nhằm làm cho protein tích điện âm. Vì điện tích của tất cả các protein khá đồng nhất nên phương pháp này phân tách chúng gần như hoàn toàn dựa trên kích thước. SDS-PAGE thường được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết của protein sau mỗi bước. Khi các protein không mong muốn được loại bỏ dần khỏi hỗn hợp, số lượng các băng được hiển thị trên gel SDS-PAGE giảm xuống, cho đến khi chỉ còn một băng đại diện cho protein mong muốn.
Sơ đồ nguyên lý của SDS-PAGE
Immunoblotting là một kỹ thuật trực quan hóa được áp dụng kết hợp với sắc ký ái lực. Các kháng thể cho một protein cụ thể được sử dụng làm phối tử trên cột sắc ký ái lực. Protein mong muốn được giữ lại trên cột, sau đó loại bỏ bằng cách rửa cột bằng dung dịch muối hoặc các tác nhân khác. Các kháng thể liên kết với các chất phóng xạ hoặc thuốc nhuộm hỗ trợ phát hiện protein đích một khi nó được tách ra khỏi hỗn hợp.
Tài liệu tham khảo
- Wingfield, P. (1998). Protein precipitation using ammonium sulfate. Current protocols in protein science, 13(1), A-3F.
- Sim, S. L., He, T., Tscheliessnig, A., Mueller, M., Tan, R. B., & Jungbauer, A. (2012). Protein precipitation by polyethylene glycol: a generalized model based on hydrodynamic radius. Journal of biotechnology, 157(2), 315-319.
- Protein precipitation. Wikipedia
- Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate. PMC4817497
- Protein precipitation techniques. Methods in Enzymology. Volume 463, 2009, Pages 331-342
