Các quy trình tách dòng không sử dụng các enzyme giới hạn hoặc ligase
Có nhiều quy trình tách dòng phân tử khác nhau. Các phương pháp enzyme truyền thống dựa trên các enzyme cắt giới hạn để tạo ra các đoạn chèn hoặc vector đích cho việc lắp ráp tiếp theo không phải là lựa chọn duy nhất. Các phương pháp như TOPO, SLIC và Gibson sẽ cung cấp cho bạn các vector tái tổ hợp liền mạch mà không cần các enzyme giới hạn (restriction endonuclease) hoặc ligase.
Bài viết liệt kê các quy trình tách dòng theo thứ tự giảm dần mức độ phụ thuộc enzyme giới hạn, hoặc ligase hoặc không phụ thuộc vào cả hai.
Phương pháp 1: Sequence and Ligate Independent Cloning (SLIC)
Như có thể suy ra từ tên, ligase không cần thiết trong phương pháp SLIC. Thay vào đó, SLIC dựa vào các đoạn mồi được thiết kế đặc biệt sẽ làm các đầu tận cùng của sản phẩm PCR tương đồng với vector đích. Hoạt tính exonuclease của T4 phage DNA polymerase sẽ tạo ra phần thò ở đầu tận cùng sản phẩm PCR và trong vị trí tương đồng của vector đích, do đó cho phép sản phẩm PCR và vector dễ dàng gắn lại để tạo ra một DNA tái tổ hợp cuối cùng.
Quy trình tách dòng SLIC
- Tạo sản phẩm PCR với cặp mồi đặc biệt có sự tương đồng với vector đích.
- Tạo dạng thẳng cho vector đích nếu bạn chưa có sẵn. Để làm được, bạn sẽ phải sử dụng một enzyme giới hạn nhưng đây sẽ là lần duy nhất bạn làm như vậy trong phương pháp này.
- Thêm T4 polymerase. Tiếp theo, bạn sẽ nối sản phẩm PCR và vector với T4 phage DNA polymerase mà không có dNTPs. Trong môi trường này, T4 polymerase có hoạt tính 3’ exonuclease sẽ cắt vector và sản phẩm PCR để tạo ra phần nhô ra. Nếu bạn thiết kế mồi chính xác, phần nhô ra từ sản phẩm PCR và vector sẽ được nối lại sau đó.
- Bổ sung dCTP. Tiếp theo thêm một nucleotide, dCTP. Điều này sẽ ngăn chặn quá trình phân giải và bắt đầu sao chép dựa vào hoạt tính polymerase. Tuy nhiên, vì không phải tất cả các dNTP đều có mặt, việc khuếch đại sẽ bị đình trệ. Kết quả cuối cùng sẽ là sản phẩm PCR của bạn được tách dòng vào vector đích của bạn với bốn chỗ chưa được nối liền.
- Biến nạp. Khi biến nạp các vector vào vi khuẩn như coli, các chỗ chưa nối liền sẽ được giải quyết.
(Ảnh: Springer)
Kỹ thuật SLIC có thể hơi phức tạp với các đoạn mồi cực dài và nó có thể không phải là lựa chọn tốt nhất của bạn cho DNA khó khuếch đại. Ngoài ra, kỹ thuật này dựa trên việc gắn đoạn mồi dài một cách chính xác, điều này chỉ có thể xảy ra nếu DNA mạch đôi được tách nhau ra một cách phù hợp và một số chuỗi DNA nhất định, chẳng hạn như DNA lặp lại hoặc DNA dạng kẹp tóc, có thể gây khó khăn.
Phương pháp 2: Quy trình tách dòng Gibson (Gibson Assembly)
Gibson Assembly giống như SLIC, ngoại trừ việc nó sử dụng một exonuclease chuyên dụng (thay vì T4 polymerase) và sử dụng một ligase để nối hoàn chỉnh các vết ghép. Ưu điểm của Gibson so với SLIC là nó là quy trình nhanh gọn chỉ diễn ra trong một ống nghiệm.
Quy trình tách dòng Gibson Assembly
- Tạo sản phẩm PCR với các đoạn mồi đặc biệt để tạo sự tương đồng giữa sản phẩm PCR và vector. Tương tự như phương pháp SLIC.
- Tạo dạng thẳng cho vector đích nếu bạn chưa có sẵn.
- Ủ các sản phẩm PCR và vector với một T5 exonuclease để cắt vector và sản phẩm PCR để tạo ra các phần nhô ra. Nếu thiết kế mồi chính xác, phần nhô ra từ sản phẩm PCR và vector sẽ nối lại.
- Thêm Phusion polymerase. Phusion polymerase gắn thêm các nu để lấp đầy các chỗ trống. Nhiệt từ máy điều nhiệt cuối cùng sẽ vô hiệu hóa exonuclease. Sau đó, sử dụng ligase để tạo vector tái tổ hợp cuối cùng.
(Ảnh: Addgen)
Ưu điểm của kỹ thuật Gibson là sử dụng ligase để nối làm tăng số lượng và hiệu quả. Một bất lợi đối với Gibson là đắt hơn – T5 exonuclease, Phusion polymerase và ligase có giá cao hơn các thành phần SLIC cộng lại. Ngoài ra, phương pháp này hoạt động tốt nhất nếu đoạn DNA dài 250 bp hoặc hơn; nếu không, bạn sẽ gặp rủi ro khi exonuclease phân giải toàn bộ sản phẩm PCR của bạn trước khi nó có thể được gắn đúng với vector. Ngoài ra, các khó khăn khác là tương tự SLIC: trình tự DNA lặp lại hoặc dạng kẹp tóc có thể khó thành công.
Phương pháp 3: Công nghệ Topoisomerase (TOPO)
Công nghệ Topoisomerase không yêu cầu mồi đặc hiệu và không cần ligase
Nguyên lý: Công nghệ này được dựa trên Topoisomerase I từ virus đậu mùa Vaccinia. Enzyme này có khả năng bám và cắt đứt DNA mạch kép. Năng lượng từ liên kết bị cắt đứt được lưu trữ dưới dạng liên kết cộng hóa trị giữa đầu 3’ của DNA bị cắt với một gốc tyrosyl của topoisomerase I. Liên kết phospho-tyrosyl này sau đó bị tấn công bởi nhóm 5’-hydroxyl của DNA ban đầu, do đó giải phóng topoisomerase. Người ta lợi dụng phản ứng này để tách dòng các sản phẩm PCR mà không sử dụng enzyme giới hạn hoặc ligase.
Các vector trong kit này được tạo ở dạng thẳng và có DNA topoisomerase I liên kết cộng hóa trị với đầu 3’ của mỗi mạch DNA. Khi ủ vector này với sản phẩm PCR muốn tách dòng, enzyme tự gắn để vector đóng vòng có chứa đoạn DNA mong muốn – sau đó nó có thể được biến nạp thành các tế bào khả biến hóa học hoặc điện biến nạp. Một số bộ kit sử dụng các vector được chia làm 2 phần và sử dụng Cre recombinase để tạo thành vector đóng vòng sau khi chèn sản phẩm PCR.
Sử dụng các kit topoisomerase có ưu điểm là bạn không còn cần phải tìm kiếm hay thiết kế vị trí cắt giới hạn trong các cặp mồi PCR – như chúng ta vẫn từng phải làm nếu sử dụng phương pháp ligase. Điều này thật tuyệt nếu sản phẩm PCR của bạn khó khuếch đại, vì việc cố ý đưa các vị trí giới hạn vào trình tự cặp mồi có thể làm giảm tính đặc hiệu hoặc hiệu suất PCR.
Quy trình tách dòng Topoisomerase (có thể khác nhau giữa các kit)
Tạo sản phẩm PCR của bạn. Thiết kế các đoạn mồi thông thường và khuếch đại đoạn DNA bạn quan tâm bằng bất kỳ quy trình PCR nào mà bạn muốn. Hãy lưu ý loại polymerase mà bạn sử dụng để thực hiện khuếch đại này vì điều này sẽ quyết định loại kit topoisomerase bạn cần sử dụng.
Mix. Trộn sản phẩm PCR của bạn và vector topoisomerase sau đó ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Biến nạp: Phản ứng tách dòng topoisomerase trong các tế bào tùy ý đi kèm với kit, hoặc dòng tế bào bạn yêu thích. Để có kết quả tốt nhất, hãy đặt trên môi trường có chứa các loại kháng sinh mà plasmid của bạn có gene kháng thuốc đó.
Lời khuyên của chuyên gia: Hãy chắc chắn bạn sử dụng chính xác bộ kit
Khi quyết định sử dụng bộ kit, bạn cần xem xét quy trình PCR bạn sử dụng, và đặc biệt là polymerase được sử dụng. Polymerase đọc sửa là polymerase kiểm tra từng nu trong quá trình tổng hợp DNA. Một polymerase đọc sửa sẽ cắt bỏ tất cả đầu 3’ thò ra ở các sản phẩm PCR, vì thế luôn tạo ra sản phẩm PCR đầu bằng. Vì vậy, nếu bạn tạo ra sản phẩm PCR để tách dòng bằng cách sử dụng một polymerase đọc sửa, như Pfu hoặc một loại polymerase đọc sửa khác có độ chính xác cao, bạn cần sử dụng một bộ kit đầu bằng như DNA Blunting Kit hay Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End).
(Ảnh: Thermo Scientific)
Nếu khuôn DNA của bạn quá khó để khuếch đại và bạn cần phản ứng PCR của mình “mạnh mẽ” hơn – như trường hợp làm việc với DNA bị hỏng hoặc mẫu DNA nhỏ – thì bạn có thể ưu tiên sử dụng polymerase không đọc sửa, chẳng hạn như Taq polymerase.
(Ảnh: Thermo Scientific)
Cuối cùng, nếu sản phẩm PCR của bạn khá dài (ví dụ 3 – 10 kb), bạn nên xem xét sử dụng bộ kit TOPO tách dòng đoạn kích thước lớn.
iceberg (biên tập)
Đọc thêm: Tất cả những gì cơ bản cần biết về tách dòng phân tử (ADN tái tổ hợp)
