Nội dung
Xét nghiệm Widal là gì?
Xét nghiệm Widal là xét nghiệm ngưng kết được sử dụng để chẩn đoán sốt ruột (sốt thương hàn hoặc phó thương hàn) bằng huyết thanh học.
Xét nghiệm này đo mức kháng thể huyết thanh ngưng kết được tạo ra chống lại kháng nguyên O (somatic) và H (flagellar) của Salmonella typhi và Salmonella paratyphi A, B và C.
Xét nghiệm Widal được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới như một công cụ chẩn đoán chính để phát hiện bệnh sốt do viêm ruột.
Xét nghiệm này dựa trên nguyên tắc phản ứng ngưng kết kháng nguyên-kháng thể.
- Các kháng nguyên tinh khiết của Salmonella gây sốt do viêm ruột có sẵn trên thị trường.
- Huyết thanh của bệnh nhân được xét nghiệm chống lại các kháng nguyên thương mại này và quan sát phản ứng ngưng kết có thể nhìn thấy được.
- Nếu huyết thanh ngưng kết, xét nghiệm được coi là dương tính.
Salmonella typhi lần lượt chứa kháng nguyên O và H trên thành tế bào và tiên mao. Salmonella paratyphi A và Paratyphi B lần lượt chứa kháng nguyên AH và BH trên tiên mao.
Kháng nguyên O của Salmonella paratyphi không được sử dụng vì chúng phản ứng chéo với kháng nguyên O của Salmonella typhi.
Những kháng nguyên này có tính sinh miễn dịch và khi được đưa vào hệ thống miễn dịch của vật chủ, chúng sẽ tạo ra các kháng thể đặc hiệu.
Kháng thể được sản xuất với số lượng có thể phát hiện được sau 6-8 ngày nhiễm bệnh. Các kháng thể đặc hiệu này được thử nghiệm trong xét nghiệm Widal theo nguyên tắc phản ứng ngưng kết.
Thử nghiệm này được giới thiệu vào năm 1896 bởi bác sĩ và nhà vi khuẩn học người Pháp Georges Fernand Isidor Widal (9 tháng 3 năm 1862 đến 14 tháng 1 năm 1929).
Ban đầu ông mô tả xét nghiệm này để chẩn đoán nhiễm trùng Salmonella paratyphi B. Sau đó nó đã được sửa đổi và sử dụng để chẩn đoán tất cả các loại sốt ruột.
Ý nghĩa của xét nghiệm Widal
Ý nghĩa của xét nghiệm Widal là phát hiện sự hiện diện của kháng thể S. typhi và S. paratyphi trong huyết thanh để chẩn đoán sốt do viêm ruột.
Nguyên tắc của xét nghiệm Widal
Xét nghiệm Widal dựa trên nguyên tắc phản ứng kháng nguyên-kháng thể thuộc loại ngưng kết. Có thể nói rằng, khi một kháng thể tương đồng phản ứng với một kháng nguyên không hòa tan cụ thể, tạo ra sự sản sinh ra kháng nguyên đó, với sự có mặt của chất điện phân cụ thể và ở nhiệt độ và pH tối ưu, một khối có thể nhìn thấy được sẽ hình thành.
Tương tự như vậy trong trường hợp xét nghiệm Widal, khi các kháng thể trong huyết thanh chống lại kháng nguyên O và H của Salmonella Typhi và Paratyphi phản ứng với các kháng nguyên O và H không hòa tan có trong thuốc thử xét nghiệm, thì sẽ xảy ra phản ứng vón cục (ngưng kết).
Bệnh nhân nhiễm vi khuẩn Salmonella gây sốt ruột có nồng độ kháng thể cao trong huyết thanh chống lại kháng nguyên O và H của vi khuẩn. Nồng độ kháng thể chống lại các kháng nguyên này sẽ đạt mức cao nhất sau 6-8 ngày nhiễm bệnh. Huyết thanh được chiết xuất từ máu của bệnh nhân nghi ngờ và cho phép phản ứng với kháng nguyên O và H được chuẩn bị đặc biệt của Salmonella typhi, cũng như kháng nguyên AH và BH của Salmonella paratyphi. Nếu có kháng thể trong huyết thanh, chúng sẽ làm ngưng kết đặc hiệu các kháng nguyên và tạo ra sự vón cục có thể nhìn thấy được.
Yêu cầu của xét nghiệm Widal
- Mẫu máu hoặc huyết thanh của bệnh nhân nghi ngờ
- Kit xét nghiệm Widal chứa kháng nguyên Salmonella
- Kháng nguyên O của Salmonella typhi
- Kháng nguyên H của Salmonella typhi
- Kháng nguyên AH của Salmonella paratyphi A
- Kháng nguyên BH của Salmonella paratyphi B
- Đối chứng dương
- Thẻ kiểm tra rộng (có thể dùng lam kính thay thế thẻ)
- Thanh bôi
Quy trình xét nghiệm Widal
Kiểm tra Widal được thực hiện bằng hai phương pháp:
- phương pháp ngưng kết trượt nhanh
- phương pháp ngưng kết ống
Sự ngưng kết trên slide có thể là xét nghiệm định tính hoặc định lượng. Phương pháp ống nhạy hơn và chính xác hơn, nhưng phương pháp ngưng kết trượt được sử dụng rộng rãi.
Chuẩn bị kháng nguyên Widal
Các kháng nguyên có thể được điều chế trong phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng chủng Salmonella typhi và paratyphi A và B thuần khiết. Tuy nhiên, hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng các bộ dụng cụ bán sẵn trên thị trường.
- Để chuẩn bị kháng nguyên H qua đêm, canh trường nuôi cấy Salmonella được xử lý bằng dung dịch formalin 0,1%.
- Để điều chế kháng nguyên O, Salmonella mới trồng trên môi trường thạch phenol được nhũ hóa với một lượng nhỏ bình thường. Trộn 1 ml huyền phù với 20 ml etanol (tuyệt đối) đun nóng ở 40 0 đến 50 0 C rồi ly tâm.
- Các kháng nguyên được xử lý bằng chất bảo quản (chloroform) và nhuộm bằng thuốc nhuộm thích hợp.
Thử nghiệm ngưng kết trượt nhanh
Kiểm tra này được thực hiện trên thẻ xét nghiệm Widal. Đây là thử nghiệm được thực hiện rộng rãi nhất và có hai loại, bao gồm:
Kiểm tra trượt định tính
Xét nghiệm này được thực hiện để phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của kháng nguyên Salmonella gây sốt ruột. Đây là một phương pháp đơn giản và nhanh chóng nhưng chúng không thể đo được mức độ kháng nguyên. Quy trình được thực hiện theo các bước sau:
- Nhỏ một giọt huyết thanh mẫu vào mỗi vòng phản ứng của thẻ xét nghiệm Widal có nhãn O, H, AH và BH.
- Nhỏ một giọt thuốc thử đối chứng dương tính vào vòng tròn phản ứng có nhãn PC
- Nhỏ một giọt thuốc thử đối chứng âm vào vòng tròn phản ứng có nhãn NC
- Thêm một giọt dung dịch kháng nguyên H từ bộ xét nghiệm Widal lên đối chứng dương và đối chứng âm
- Thêm một giọt dung dịch kháng nguyên O, H, AH và BH lên huyết thanh mẫu trong vòng phản ứng tương ứng của chúng
- Trộn đều dung dịch huyết thanh và kháng nguyên trong mỗi vòng phản ứng bằng que bôi
- Lắc nhẹ phiến kính để xoay hỗn hợp phản ứng theo chuyển động tròn trong vòng tròn phản ứng
- Quan sát sự ngưng kết vĩ mô trong vòng một phút.
Kiểm tra slide định lượng (bán định lượng)
Xét nghiệm này được thực hiện để đo mức độ kháng nguyên có trong mẫu huyết thanh. Điều này chỉ được thực hiện nếu xét nghiệm định tính là dương tính. Quy trình được thực hiện theo các bước sau:
- Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vào vòng phản ứng đầu tiên
- Đặt lần lượt 5, 10, 20, 40 và 80 μl mẫu thử (huyết thanh) vào vòng tròn phản ứng còn lại
- Thêm một giọt huyền phù kháng nguyên cho thấy kết quả xét nghiệm dương tính (tức là sự ngưng kết) trong xét nghiệm định tính ở mỗi vòng phản ứng
- Trộn đều nội dung bằng cách sử dụng que bôi
- Lắc nhẹ phiến kính để xoay hỗn hợp phản ứng theo chuyển động tròn trong vòng tròn phản ứng
- Quan sát sự ngưng kết vĩ mô trong vòng một phút.
Thử nghiệm ngưng kết ống (Thử nghiệm định lượng trong ống)
Thử nghiệm này được thực hiện trong ống thủy tinh. Các loại ống khác nhau ban đầu được sử dụng như:
- ống Dreyer cho kháng nguyên H
- ống Felix cho kháng nguyên O
Trong các phương pháp thử hiện đại, ống Kahn hay ống nghiệm đơn giản được sử dụng rộng rãi.
Xét nghiệm này phát hiện sự hiện diện của kháng thể cũng như đo hiệu giá kháng thể. Việc kiểm tra được thực hiện theo các bước sau:
- Sắp xếp 4 bộ Khan Tube khô sạch, mỗi bộ có 8 ống được dán nhãn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8.
- Thêm 1,9 ml dung dịch muối vô trùng đẳng trương (0,85%) vào ống 1 của mỗi bộ
- Thêm 1,0 ml nước muối vô trùng đẳng trương vào các ống còn lại (2 – 8) của mỗi bộ
- Thêm 0,1 ml huyết thanh mẫu vào ống 1 của mỗi bộ và trộn đều
- Từ ống 1 của mỗi bộ, chuyển 1,0 ml huyết thanh đã pha loãng vào mỗi ống 2 của bộ tương ứng.
- Từ ống 2 của mỗi bộ, chuyển 1,0 ml huyết thanh pha loãng vào mỗi ống 3 của bộ tương ứng.
- Tiếp tục quá trình pha loãng nối tiếp này cho đến ống 7 của mỗi bộ.
- Từ ống số 7 của mỗi bộ, loại bỏ 1,0 ml dung dịch pha loãng. (Không bao giờ chuyển sang ống 8).
- Thêm 1 giọt kháng nguyên Widal-O vào mỗi ống của bộ 1, 1 giọt kháng nguyên Widal-H vào mỗi ống của bộ 2, 1 giọt kháng nguyên Widal-AH vào mỗi ống của bộ 3 và 1 giọt kháng nguyên Widal- BH trong mỗi ống của bộ 4.
- Trộn đều hỗn hợp phản ứng, đậy kín các ống và ủ ở 370C trong khoảng 18 giờ (qua đêm) Sau khi ủ, tìm kiếm sự ngưng kết ở đáy ống.
Giải thích kết quả xét nghiệm Widal
Kết quả kiểm tra slide định tính
Xét nghiệm dương tính (sự hiện diện của kháng nguyên Salmonella) = Sự ngưng kết trong vòng một phút
Xét nghiệm âm tính (không có kháng nguyên Salmonella) = Không có sự ngưng kết
Kết quả kiểm tra slide định lượng (bán định lượng)
Hiệu giá kháng thể của huyết thanh xét nghiệm được đọc là độ pha loãng huyết thanh cao nhất cho phản ứng dương tính (ngưng kết nhìn thấy được).
Hiệu giá kháng thể lớn hơn 1:80 được coi là đáng kể.
Hiệu giá có thể được đọc tương ứng với bảng dưới đây:
Kết quả xét nghiệm ngưng kết ống (Thử nghiệm định lượng ống)
Hiệu giá kháng thể được đọc là độ pha loãng huyết thanh cao nhất cho phản ứng dương tính (ngưng kết nhìn thấy được). Hiệu giá kháng thể lớn hơn 1:80 được coi là đáng kể. Hiệu giá có thể được đọc tương ứng với bảng dưới đây:
Ứng dụng xét nghiệm Widal
- Dùng để chẩn đoán nhanh bệnh sốt do viêm ruột
- Dùng để xác định serovar (Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B) của vi khuẩn Salmonella gây sốt do viêm ruột
Giới hạn của xét nghiệm Widal
Kết quả dương tính giả ở người đã tiêm phòng hoặc người đã nhiễm bệnh trước đó.
Agglutinin chỉ xuất hiện trong huyết thanh sau 6-8 ngày nhiễm bệnh và tồn tại đến tuần thứ 4 nhiễm trùng. Vì vậy, xét nghiệm Widal có độ nhạy và hiệu quả thấp khi xét nghiệm trước tuần thứ nhất và sau tuần thứ 4 nhiễm bệnh.
Được coi là xét nghiệm giả định, vì vậy cần điều tra thêm để xác nhận sốt do viêm ruột
Phản ứng chéo với kháng thể được tạo ra chống lại bệnh sốt phát ban, ký sinh trùng sốt rét và nhiễm trùng Salmonella không đường ruột .
Xét nghiệm ống định lượng đòi hỏi thời gian dài hơn.
Điều trị bằng kháng sinh làm giảm phản ứng kháng thể. Tương tự, rối loạn miễn dịch có thể gây ra mức độ sản xuất kháng thể thấp. Những điều này sẽ cho kết quả âm tính giả.
Mức độ hiệu giá Agglutinin có ý nghĩa lâm sàng là khác nhau ở những nơi khác nhau và cũng khác nhau ở mỗi người.
Tài liệu tham khảo
- https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/widal-test
- Song JH, Park M, Na DS, Moon HB, Pai CH. Detection of Salmonella typhi in the blood of patients with typhoid fever by PCR. J Clin Microbiol 1993;31:1439-1443.
- Kenneth E.Sanderson, Shu-LinLiu1, LeTang and Randal N.Johnston.(2015).Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi A. Molecular Medical Microbiology (2 eds.). (2):1275-1306.
