Nội dung
Làm sao để hạn chế bị nhiễm khi PCR?
Bạn cẩn thận set up một thí nghiệm PCR, chờ đợi trong sự hồi hộp đến khi nó kết thúc, chạy điện di, và mong đợi một khám phá lớn. Nhưng thay vì thấy điều bạn đang mong đợi, bạn thấy một băng to đùng xấu xí, và khủng khiếp nhất là, có cả băng ở đối chứng âm. Phản ứng của bạn đã bị nhiễm. Làm sao để khắc phục vấn đề này và tránh gặp lại trong tương lai?
Nhiễm PCR là gì?
Có thể hiểu đơn giản đó là khi bất kỳ thành phần không mong muốn nào đó có mặt trong phản ứng PCR của bạn, điều đó có thể không gây ra hiện tượng gì (và bạn không phát hiện ra) hoặc gây ra hậu quả rõ ràng – thí nghiệm của bạn không đáng tin cậy.
Nhiễm ADN
Trong PCR, hơn chục triệu bản sao của một khuôn ADN được tạo ra, hơn nữa chúng là các đoạn có kích thước nhỏ (do PCR thông thường chỉ khuếc đại các đoạn ngắn hơn 1 kb). Vì thế, nguồn nhiễm PCR lớn nhất chính là các sản phẩm từ phản ứng PCR trước đó bị bắn thành sol khí (các giọt dịch li ti chứa cả DNA) khi bạn mạnh tay mở nắp ống hoặc khi thực hiện pipetting sản phẩm PCR bằng một pipet dịch chuyển khí. Một khi các giọt này được tạo ra, do kích thước rất nhỏ, chúng rất dễ di chuyển tới các dụng cụ và các bề mặt hay đi vào bên trong ruột/thân pipet, đó là con đường để đưa các sản phẩm PCR lần này đến các phản ứng PCR lần sau.
Một nguồn nhiễm phổ biến thứ hai là ADN plasmid. Plasmid dùng trong thực nghiệm có kích cỡ khoảng dưới 5 kb, do đó cũng rất dễ tồn tại trong các sol khí hoặc bám trên nắp ống đựng mẫu. Nên nhớ rằng DNA càng nhỏ thì càng dễ bị nhiêm vào phản ứng PCR.
Khác biệt giữa pipet dịch chuyển khí (trái) và pipet dịch chuyển vị trí (phải)
Nhiễm các dạng khác
Trường hợp này hiếm hơn khi ống nghiệm, đầu tip vẫn còn bám những vật liệu trong quá trình sản xuất ra chúng trong khi chúng ta lại không khử trùng đúng yêu cầu. Các hợp chất khi đó có thể là DNase, RNase, nội độc tố, kim loại nặng, vi khuẩn … Giả sử đầu tip pipet có dính vi khuẩn và vì thế vi khuẩn được đưa vào phản ứng PCR. Do nhiệt độ cao của PCR, vi khuẩn vỡ ra và trong một số trường hợp, mồi PCR có thể khuếch đại được trình tự nào đó trong genome vi khuẩn.
Những gì trong PCR có thể bị nhiễm
Thực sự mọi thứ liên quan đến một phản ứng PCR cũng có thể bị nhiễm. Đó có thể là:
- Môi trường phòng thí nghiệm như là pipet, đầu tip, tay, mặt bàn, máy ly tâm;
- Các hóa chất dùng cho PCR như polymerase, đệm, nucleotides, nước và các hóa chất khác.
Những con đường gây nhiễm cho phản ứng PCR
Nhiễm vào pipet là sự cố phổ biến nhất và là con đường chính đưa đến sự nhiễm một phản ứng PCR
Có ba loại nhiễm bắt nguồn từ pipet: nhiễm từ pipet sang mẫu, nhiễm từ mẫu sang pipet và nhiễm từ mẫu sang mẫu.
Nhiễm từ pipet sang mẫu diễn ra khi đầu tip pipet hoặc chính pipet không sạch sẽ. Đầu tip hiện nay thuộc nhiều cấp độ sạch khác nhau từ các nhà sản xuất. Các mức độ sạch có thể được chia thành:
- Không chứng nhận tinh sạch
- Chứng nhận không nhiễm DNase, RNase và nội độc tố
- Đã khử trùng để không còn vi sinh vật sống.
Nhiễm từ mẫu sang pipet
Loại nhiễm này xảy ra khi pipetting một dung dịch hoặc các hạt sol khí từ đó đi vào thân pipet nếu bạn đang dùng tip không lọc hoặc tip dịch chuyển khí.
Nhiễm từ mẫu sang mẫu
Nhiễm từ mẫu vào mẫu (hay còn gọi là nhiễm “carryover”) diễn ra khi sol khí hoặc dịch sót lại từ một mẫu được mang sang mẫu tiếp theo. Ví dụ, điều này có thể diễn ra khi cùng một đầu tip được dùng nhiều lần.
Làm sao để phát hiện bị nhiễm và nhiễm từ đâu
Chạy đối chứng âm (NTC)
Chúng ta biết rằng lúc nào cũng nên chạy đối chứng âm PCR. Nhưng đôi khi chúng ta lại biện hộ để không làm điều đó. Chúng ta hay đưa ra lý do như “Thí nghiệm nào lúc nào cũng chuẩn chỉ!”, “Tôi muốn tiết kiệm hóa chất” hay “Tôi không có thời gian”. Nhưng hãy học từ những kinh nghiệm xương máu: phải luôn có đối chứng âm. Không có đối chứng âm thì PCR bị nhiễm đôi khi sẽ không thể phát hiện được, tốn thời gian trong việc khắc phục vấn đề và hiện tượng nhiễm dần dần lan ra cả phòng thí nghiệm của bạn.
Một đối chứng âm cho PCR thường chỉ chứa master mix PCR thông thường (polymerase, primers, buffer, nucleotides) nhưng không cho khuôn DNA, mà cho nước. Phản ứng này sẽ không tạo ra sản phẩm PCR nào. Khi đó, nếu bạn thu được băng trên gel, chắc hẳn bạn đã bị nhiễm … từ đâu đó. Để xác định sự nhiễm là do hóa chất nào, bạn tiếp tục lặp lại quy trình PCR bằng hóa chất mới cùng với một hóa chất cũ đã dùng cho quy trình trước đó. Nếu không muốn tốn thêm nhiều thời gian, bạn có thể bỏ qua câu hỏi “nhiễm từ đâu” và thay thế toàn bộ hóa chất.
Tuy nhiên, nếu đã thay thế hóa chất mà bạn vẫn tiếp tục nhiễm đối chứng âm, có lẽ chính pipet của bạn là một thứ chứa đựng nhiều ADN bên trong thân!
Bạn đã từng set up đối chứng nào khác ngoài đối chứng âm?
Một đối chứng “reagent blank” chứa tất cả các hóa chất được dùng trong quá trình chuẩn bị mẫu khuôn ADN nhưng không cho khuôn ADN. Bởi vì biết đâu được, chính các hóa chất bạn dùng để tách chiết, tinh sạch, pha loãng mẫu ADN lại chứa một nguồn ADN khác. Một quy trình PCR có reagent blank có độ tin cậy cao nhất.
Ngoài ra, sự nhiễm cũng có thể được phát hiện từ đối chứng dương. Sự có mặt của băng không dự đoán trước ở đối chứng âm và dương có thể cho biết PCR bị nhiễm ADN.
Liệu có phải ADN từ chính kỹ thuật viên làm PCR?
Nhiều phòng thí nghiệm còn xây dựng hồ sơ DNA của các thành viên (giải trình tự cả bộ gen), vì thế việc nhiễm DNA của người trong lab có thể được phát hiện bằng sự có mặt của DNA của người đó trong phản ứng đối chứng âm. Phát hiện nhiễm DNA từ các mẫu khác với thật sự là vấn đề.
Làm sao để hạn chế tối đa bị nhiễm khi PCR?
Làm việc trong không gian nhất định
Set up các phản ứng PCR ở nơi tránh xa chỗ thao tác với sản phẩm PCR. Tốt nhất là trong một tủ hút hay tủ an toàn sinh học có trang bị đèn UV. Trước mỗi lần PCR, hãy chiếu đèn UV trong tối thiểu 15-20 phút vì tia UV làm đứt gãy DNA, hạn chế việc khuếch đại DNA lạ.
- Nơi chuẩn bị mẫu
- Nơi set up PCR
- Nơi chạy phản ứng PCR
- Nơi phân tích sản phẩm PCR
Nên phân chia cụ thể từng khu vực cho từng bước trong quy trình PCR
Lưu ý với các dụng cụ dùng cho PCR
- Sử dụng đầu tip có lọc hoặc đầu tip dịch chuyển vị trí để ngăn sol khí di chuyển vào trong thân pipet sẽ mang lại sự yên tâm nhất
- Luôn thay đầu tip cho mỗi mẫu
- Chỉ sử dụng các dụng cụ được ấn định. Pipet, đầu tip, máy ly tâm, máy vortex bạn dùng PCR chỉ nên ấn định là dành cho PCR. Đừng để sản phẩm PCR hay DNA ở gần những vật dụng này.
Sử dụng đầu tip có lọc sẽ giúp hạn chế rất nhiều hiện tượng nhiễm pipet
Lưu ý các thao tác PCR
– Để hạn chế nguy cơ nhiễm từ mẫu vào pipet, hãy thực hiện những lời khuyên sau đây:
- Luôn nhả piston từ từ để ngăn hình thành sol khí và dịch bắn tung tóe không kiểm soát được bên trong đầu tip
- Luôn hút pipet ở trạng thái thẳng đứng khi pipetting để ngăn cản dung dịch đi vào thân pipet.
- Sử dụng đầu tip lọc hoặc đầu tip dịch chuyển vị trí để ngăn việc chuyển sol khi từ mẫu và thân pipet
– Sự nhiễm pipet sang mẫu có thể tránh được bằng cách:
- Dùng đầu tip có độ tinh sạch phù hợp với thí nghiệm của mình
- Sử dụng đầu tip có phin lọc để ngăn cản sol khí đi vào thân pipet
- Luôn đổi đầu tip sau khi hút mỗi mẫu.
- Thường xuyên khử trừng, khử khuẩn pipet hoặc các thành phần có thể tiếp xúc với mẫu.
– Để hạn chế nhiễm mẫu sang mẫu (carryover)
Một trong những phương pháp phổ biến nhất để ngăn nhiễm carryover là dùng uracil DNA glycosylase (UDG). Một phần hay toàn bộ dTTP trong phản ứng PCR bị thay thế bằng dUTP và vì thế tất cả các sản phẩm PCR được tạo ra là chứa U. Trước khi tiến hành PCR lần sau, ủ với UDG làm loại đi đơn vị khuếch đại của lần PCR trước đó.
Một số thói quen khác
- Mang mặc đồ của phòng thí nghiệm chỉ định: bạn nên mặc đồ bảo hộ chỉ định để tiến hành PCR để tránh DNA của chính bạn có thể nhiễm vào mẫu. Đồ này KHÔNG phải đồ mà bạn mặc khi làm việc với sản phẩm PCR.
- Thay đổi găng tay thường xuyên. Nếu bạn rời khỏi bước set up thí nghiệm PCR để làm việc gì khác – lấy thêm hóa chất, nghe điện thoại, dùng bút – hãy thay găng tay trước khi quay lại set up phản ứng.
- Luôn chạy tối thiểu là đối chứng âm.
- Giữ hóa chất PCR và sản phẩm PCR riêng rẽ. Cũng như việc không set up phản ứng ở nơi phân tích sản phẩm PCR. Đừng bao giờ để chung hóa chất và sản phẩm PCR, tốt nhất là để chúng ở các tủ lạnh khác nhau.
- Chia nhỏ. Bất kể bạn cẩn thận đến đâu, việc nhiễm vẫn có thể diễn ra. Sự nhiễm không chỉ phải trả giá bằng thời gian mà còn bằng tiền của, khi bạn phải ném các hóa chất nhiễm đi. Vì thế, hãy pha loãng hóa chất vào các ống nghiệm nhỏ hơn và chỉ làm việc với một phần nhỏ mỗi lần. Điều này không chỉ giúp tránh nhiễm cho hóa chất còn lại, mà còn kéo dài tuổi thọ của hóa chất.
- Để riêng ống nghiệm PCR/đầu tip/rack . Đánh dấu tất cả các đồ dùng vật dụng cho PCR kể trên và nói với các thành viên khác hãy chú ý đến điều đó.
- Mở ống nghiệm chứa DNA/sản phẩm PCR thật cẩn thận. Một số người mở ống nghiệm bằng một tay, tức là dùng 4 ngón để giữ ống và ngón cái để bật nắp. Cách này có thể thật nhanh nhưng nó có thể khiến dịch bám ở nắp bị bắn thành sol khí – một nguồn nhiễm điển hình. Hãy bỏ thêm chút thời gian để mở ống nghiệm cẩn thận bằng hai tay.
- Sử dụng mastermix và cho khuôn sau cùng. Thời gian bạn thao tác với khuôn càng ít, bạn càng làm giảm khả năng nhiễm. Vì thế, luôn set up các phản ứng PCR bằng master mix theo thứ tự: nước, đệm, nucleotide, polymerase và cuối cùng mới cho khuôn.
Nếu PCR của bạn đang bị nhiễm?
- Khử trùng lại đồ dùng thí nghiệm và thay mới toàn bộ hóa chất
- Dùng cồn 70% hoặc chất tẩy trùng để lau sạch các bề mặt hay các vật dụng bạn cầm nắm vào lúc làm PCR
- Chiếu đèn UV khu vực làm PCR hoặc tốt nhất là toàn bộ phòng thí nghiệm qua đêm.
Chúc bạn PCR vui vẻ và không bị nhiễm !
TÀI LIỆU THAM KHẢO
https://bitesizebio.com/20773/clean-up-your-act-how-to-clean-up-pcr-contamination/
Đọc thêm: 12 mẹo là chủ kỹ năng pipet
tapchisinhhoc.com
No Responses