Làm thế nào để PCR khuếch đại các đoạn ADN khó
Chia sẻ bởi Vicki Doronina trên bitesizebio.com.
“Trong quá trình nghiên cứu sau đại học, tôi đã thực hiện một phản ứng PCR với một protocol chưa được tối ưu hóa trước trên một mẫu khuôn không quá phức tạp. Vì vậy, vận xui của tôi đã quay trở lại, khi mà ngay phần đầu trong nghiên cứu postdoc của tôi, tôi đã phải khuếch đại một khuôn ADN chứa một cấu trúc stem-loop (như hình minh họa) giàu GC dài 35 bp, điều này có vẻ vô cùng khó khăn.
Đây là lần “đụng độ” đầu tiên của tôi với các trình tự khó, nhưng không phải là lần cuối cùng. Sau khi thấu hiểu PCR từng chút một, tôi đã tìm ra các kinh nghiệm sau đây để khuếch đại các mẫu khó.
Khuôn PCR
Trước hết phải chắc chắn rằng chúng ta có mẫu ADN chất lượngtốt. Tin tôi đi, việc thêm vào phản ứng một cách tù mù lượng mẫu không đủ và/hoặc mẫu bẩn là rất dễ xảy ra. Vì vậy, rất đáng để dành thời gian điện di mẫu ADN của bạn trên gel cũng như check nồng độ mẫu bằng máy đo quang phổ, để thấy mức độ nhiễm bẩn – đặc biệt là nếu bạn nhận mẫu từ người khác. Ngay cả khi bạn chắc chắn rằng ADN của bạn không bị đứt gãy, bạn có lẽ nên tinh sạch lại nó hoặc tạo một mẫu mới – điều đó thật tuyệt vời đối với bất kỳ phản ứng PCR nào, bao gồm các phản ứng PCR khó.
Giai đoạn gắn mồi
1. Nếu đã chắc chắn rằng các vấn đề của bạn không phải do chất lượng DNA hoặc hỗn hợp dNTP, bạn phải biết lý do tại sao mẫu khuôn của bạn khó khuếch đại, ví dụ: hàm lượng GC hoặc AT cao, cấu trúc bậc hai bền hoặc các đoạn khuôn dài – 10 kb là quá dài đối với Taq polymerase thông thường. Đối với hai trường hợp đầu tiên, bạn có thể thử sử dụng chất bổ sung. DMSO đã giúp tôi khuếch đại đoạn stem-loop 35 bp và tôi cũng biết rằng những người khác trong cùng phòng thí nghiệm đã áp dụng cách này thành công. BSA không gây ra vấn đề gì mà đôi khi có ích. Bạn cũng có thể cân nhắc sử dụng một trong những chất hỗ trợ này (mỗi lần thử một chất). Một mẫu khuôn size XXL ? (ADN rất dài) có thể phải cần đến các polymerase đặc biệt, ví dụ Phusion.
2. Hãy chắc chắn rằng mồi đã tối ưu. Nếu có thể, hãy thiết kế mồi sao cho ở tận cùng của mồi có vài gốc C hoặc G (lý tưởng nhất là ở cả hai đầu của mồi, nhưng đầu 3’ quan trọng hơn) – điều này làm tăng độ mạnh của liên kết bổ sung khi gắn mồi. Các đoạn mồi không được chứa các cấu trúc bậc hai bền và, nếu trình tự cho phép, hàm lượng GC của mồi nên trong khoảng 50-60%. Độ dài mồi tối thiểu nên là 20 bp; tăng mồi thêm 10 bp cũng tăng độ đặc hiệu khi gắn mồi. Các cặp mồi nên có nhiệt độ nóng chảy (Tm) chênh nhau không quá 5oC. Đôi khi tịnh tiến mồi của bạn 20 – 30 bp về phía trước hoặc phía sau so với vị trí dự định ban đầu có lẽ cũng hiệu quả đấy.
Giai đoạn khuếch đại
3. Nói chung, bạn có thể tăng khả năng khuếch đại trình tự quan tâm bằng cách giảm mức độ nghiêm ngặt của phản ứng PCR. Điều này đạt được bằng cách:
– Hạ nhiệt độ gắn mồi xuống 45 – 50 ° C;
– Tăng nồng độ Mg, giúp cải thiện khả năng khuếch đại (ít nhất là với các trình tự khuôn giàu AT). Hỗn hợp đệm tiêu chuẩn cho phản ứng PCR thường chứa 2 mM Mg; nồng độ này có thểtăng lên đến 10 mM.
– Thời gian kéo dài thường là khoảng 1 phút / mỗi kb độ dài mẫu, nhưng thời gian này có thể dài gấp đôi cho chắc ăn. Bạn có thể ngủ trong lúc máy PCR đang chạy kia mà.
4. Bạn có thể cần thử protocol của “touch–down” hoặc “touch-up” PCR . Các quy trình này bắt đầu từ nhiệt độ gắn mồi cao (“touch-down”) hoặc thấp (“touch-up”) trong vài chu kỳ, sau đó tăng nhiệt độ thêm vài độ trong khoảng chục chu kỳ, v.v. Ý tưởng đằng sau các protocol này là tại một số điểm nhiệt độ, mồi của bạn gắn vào khuôn (ở nhiệt độ tối ưu của chúng) và bắt đầu khuếch đại.
Khuếch đại
5. Tăng số chu kỳ từ 30 lên 40 và thử thêm enzyme sau 20 chu kỳ xem sao.
6. Sử dụng máy PCR có chế độ gradient nhiệt, có khả năng kiểm tra nhiều nhiệt độ gắn mồi cùng lúc, giúp bạn tiết kiệm rất nhiều công sức. Nếu bạn kết hợp máy đó với việc thay đổi nồng độ Mg và / hoặc loại polymerase khác nhau, bạn sẽ thử được rất nhiều điều kiện chỉ trong một lần chạy.
Nếu phương pháp tự tối ưu hóa không giúp được, bạn có thể cân nhắc sử dụng các hỗn hợp mix sẵn và polymerase đặc biệt được tối ưu hóa riêng cho các trình tự khuôn khó, ví dụ DyNAzymeEXTDNAPolymerase hoặc FastStartTHERTaq.
Hãy để lại ý kiến comment và chúng tôi sẽ rất vui khi nghe các bạn chia sẻ về các mẹo khuếch đại trình tự khuôn khó, cụ thể, sản phẩm thương mại nào hoạt động tốt trong trường hợp nào, vì nhiều khi chúng ta nên tin tưởng đồng nghiệp hơn là nghe quảng cáo.
Đọc thêm
Làm sao để hạn chế bị nhiễm khi PCR
Hiểu biết căn bản về real-time PCR
tapchisinhhoc.com
No Responses