Nội dung
Hệ thống CRISPR Cas9 là gì
CRISPR là viết tắt của Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, là các trình tự DNA palindromic ngắn được lặp lại tâp trung thành một cụm. CRISPR thường được tìm thấy trong hệ gen của vi khuẩn và các sinh vật khác. RNA được mã hóa từ CRISPR cùng với các enzyme thuộc họ Cas có vai trò như là hàng rào miễn dịch của tế bào chủ đối với virus, cái mà ngày nay được gọi là hệ thống CRISPR Cas9.
Các nhà sinh học đang nắm lấy sức mạnh của công cụ chỉnh sửa gen để khám phá hệ gen
Rất nhiều cuộc bàn luận về hệ thống CRISPR Cas9 xoay quanh tiềm năng của nó trong điều trị bệnh tật hay chỉnh sửa các gen của phôi người, nhưng các nhà nghiên cứu nói rằng cuộc cách mạng thực sự đang diễn ra trong phòng thí nghiệm.
Cái mà CRISPR mang lại, cũng là điều các nhà sinh học mong đợi, rất đặc biệt: khả năng nhắm tới một đích và nghiên cứu các trình tự DNA nhất định trong phạm vi rộng lớn của một hệ gen. Và chỉnh sửa DNA mới chỉ là một thủ thuật mà nó có thể được áp dụng vào. Các nhà nghiên cứu đang kiếm tìm các công cụ mà giúp họ có thể gửi các protein tới các đích DNA chính xác để bật hoặc tắt gen, và thậm chí là thiết kế toàn bộ “mạch sinh học” (biological circuits) – với mục tiêu dài hạn là hiểu về các hệ thống của tế bào và bệnh tật.
Vi khuẩn sử dụng hệ thống CRISPR-Cas để miễn dịch virus (Cre: The Doudna Lab)
“Đối với các nhà sinh học phân tử khiêm nhường, đây thực sự là một cách cực kỳ mạnh để hiểu về cách hoạt động của cả hệ gen,” theo Daniel Bauer, nhà huyết học tại Bệnh viện Nhi Boston, Massachustts. “Nó thực sự đã mở ra hàng loạt câu hỏi mà bạn có thể trả lời,” Peggy Farnham, một nhà sinh học phân tử tại đại học Nam California, Los Angeles bổ sung.
Dưới đây, Nature đề cập đến năm hướng mà hệ thống CRISPR Cas9 đang làm để thay đổi cách mà các nhà sinh học có thể chỉnh sửa từng chút của tế bào.
BROKEN SCISSORS – CAS9 KHÔNG CẮT DNA
Có hai thành phần chính tạo nên hệ thống CRISPR-Cas9: một enzyme Cas9 có thể cắt DNA như một cây kéo phân tử, và một phân tử RNA nhỏ định hướng cho cây kéo đến một trình tự DNA đặc hiệu. Bộ máy sửa chữa DNA tự nhiên của tế bào thường sửa chữa vết cắt – nhưng cũng hay gây ra các sai sót. Đó là một lợi thế cho các nhà khoa học muốn phá hủy một gen để tìm hiểu về chức năng của gen đó.
Nguồn ảnh: Dharmacon.gelifesciences.com
Mã di truyền rất nghiệt ngã: chỉ một lỗi nhỏ được tạo ra trong quá trình sửa chữa có thể thay đổi hoàn toàn trình tự protein mà nó mã hóa, hoặc chấm dứt toàn bộ sự sản xuất loại protein đó. Hệ quả là, các nhà khoa học có thể nghiên cứu điều gì xảy ra với tế bào hoặc sinh vật khi protein hay gen bị khiếm khuyết.
Nhưng cũng có một con đường chỉnh sửa khác, là đôi khi sửa chữa vết đứt gãy được dựa theo một khuôn DNA. Nếu các nhà nghiên cứu cung cấp một khuôn, họ có thể thay đổi hệ gen với gần như bất cứ trình tự nào mà họ mong muốn tại hầu hết các vị trí họ chọn lựa.
Từ 2012, khi mà các phòng thí nghiệm lúc bấy giờ đang chạy đua để xác định các công cụ chỉnh sửa gen này có thể cắt DNA người tốt đến mức nào, một nhóm nghiên cứu đã quyết định theo một hướng tiếp cận khác.
“Điều đầu tiên chúng tôi làm: chúng tôi phá hủy chiếc kéo,” theo lời Jonathan Weissman, một nhà khoa học tại đại học California, San Francisco (UCSF).
Weissman đã học được phương pháp đó từ Stanley Qi, một nhà sinh học tổng hợp (synthetic biologist) đang làm việc tại Đại học Stanford California, người đã làm đột biến enzyme Cas9 (nên gọi là chiếc kéo gãy – broken scissors) khiến nó vẫn bám vào DNA tại vị trí khớp với RNA dẫn đường (gRNA) của nó, nhưng không cắt DNA nữa. Thay vào đó, enzyme nằm ở đó và ngăn cản các protein khác phiên mã DNA này thành RNA.
Hệ thống này cho phép họ tắt một gen mà không thay đổi gì trình tự DNA. Nhóm nghiên cứu sau đó đã lấy Cas9 “chết” và thử một điều mới: họ đã gắn nó vào một phần của protein khác, là protein kích hoạt biểu hiện gen. Với một vài chỉnh sửa khác, họ đã xây dựng một cách để bật tắt gen trong tương lai.
Một số phòng nghiên cứu đến nay đã công bố một số dạng biến đổi của phương pháp này; nhiều lab khác đang chạy đua để khai thác nó cho nghiên cứu của mình (Xem phần Hacking CRISPR bên dưới). Một ứng dụng để cho ra một cách nhanh chóng hàng trăm dòng tế bào khác nhau, mỗi dòng chứa một loại gRNA nhắm đến một gen đặc hiệu.
Martin Kampmann, một nhà sinh học hệ thống khác tại UCSF, hy vọng sàng lọc các tế bào này để nghiên cứu liệu bật tắt một số gen sẽ tác động ra sao đến sự tồn tại của các neuron trong hoàn cảnh tích tụ các protein gây độc – một cơ chế được cho là nằm sâu bên trong một số dạng thoái hóa thần kinh, bao gồm Alzheimer. Kampmann đã thực hiện một sàng lọc tương tự với RNA can thiệp (RNAi), một kỹ thuật cũng làm tắt các gen và có thể xử lý nhiều phân tử cùng lúc, nhưng nó vẫn còn nhiều hạn chế. “RNAi là một viên đạn với các tác động lệch đích đã được biết rõ,” ông nói. “CRISPR là một cây dao mổ cho phép bạn thao tác chính xác hơn.”
Weissman và cộng sự của mình, bao gồm một nhà sinh học hệ thống khác, Wendell Lim đã điều chỉnh hơn nữa phương pháp trong đó dựa vào một gRNA dài hơn, với các cấu hình (motif) bám vào các protein khác nhau. Điều này cho phép họ hoạt hóa hay bất hoạt tại ba vị trí khác nhau trong cùng một thí nghiệm. Lim nghĩ rằng hệ thống CRISPR còn có thể thao tác năm trình tự đồng thời. Hạn chế của nó, ông nói, có lẽ là ở số lượng gRNAs và protein có thể được bắn vào trong một tế bào mà thôi.
Sức mạnh kết hợp này đã kéo Ron Weiss, một nhà sinh học tổng hợp tại viện MIT, Cambridge vào cơn sốt của kỹ thuật CRISPR Cas9. Weiss và đồng nghiệp cũng đã tạo ra nhiều tinh chỉnh gen trong một thí nghiệm duy nhất, khiến cho việc xây dựng các “mạch sinh học” nhanh và dễ dàng hơn, ví dụ, biến một bộ máy chuyển hóa của tế bào thành một nhà máy năng lượng sinh học. “Mục tiêu quan trọng nhất của sinh học tổng hợp là có thể lập trình các hành vi phức tạp thông qua sự tạo thành các mạch tinh vi này.”
EPIGENETIC CRISPR – BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN NGOẠI GEN
Khi nhà di truyền học Marianne Rots bắt đầu sự nghiệp của mình, bà đã mong muốn tìm ra các cách chữa bệnh mới. Bà đã nghiên cứu liệu pháp gen, là phương pháp nhắm vào các gen bị đột biến trong bệnh nhân. Nhưng sau một vài năm, bà đã quyết định thay đổi hướng đi.
“Tôi đã thấy rằng các bệnh gây bởi rối loạn mô hình biểu hiện gen nhiều hơn nhiều, do từng đột biến duy nhất thì không nhiều đến vậy; nên tôi quyết định tập trung vào nó,” theo lời bà Rot, tại Đại học Y Groningen, Hà Lan. Cách tốt nhất để kiểm soát hoạt động gen là điều chỉnh di truyền ngoại gen, hơn là thay đổi chính hệ gen.
Hệ di truyền ngoại gen (hay di truyền biểu sinh) là tập hợp các thành phần hóa học được gắn vào DNA và gắn vào các protein đóng gói DNA (tức là Histone). Chúng có thể cho phép các protein cần cho biểu hiện gen tiếp cận đến DNA, tháo xoắn DNA hoặc đóng xoắn lại. Các dấu ấn ngoại gen thay đổi theo thời gian: chúng được thêm vào hoặc bị loại đi khi một sinh vật phát triển hay khi môi trường thay đổi.
Trong một vài năm qua, hàng triệu đô-la đã được bơm vào các nghiên cứu xác định những dấu ấn di truyền này trong các tế bào khác nhau của người, và các mô hình di truyền ngoại gen có liên hệ với mọi thứ, từ hoạt động não tới sự phát triển ung thư. Nhưng nếu không có khả năng thay đổi các dấu ấn tại những vị trí đặc hiệu, các nhà nghiên cứu không thể xác định liệu họ có thật sự gây ra các biến đổi sinh học hay không.
“Lĩnh vực này đã gặp phải nhiều trở ngại bởi chúng tôi không có các loại công cụ mà các nhà di truyền học có, mà nhờ chúng họ có thể tiếp cận và kiểm tra trực tiếp chức năng của một gen,” theo lời Jeremy Day, một nhà thần kinh học tại Đại học Alabama, Birmingham.
Hệ thống CRISPR Cas9 có thể thay đổi những điều này. Vào tháng Tư năm 2015, Charles Gersbach, một nhà kỹ thuật di truyền tại Đại học Duke (Durham, Bắc Carolina) và các cộng sự đã công bố một hệ thống có thể thêm các gốc acetyl – một loại dấu ấn ngoại gen – vào histone sử dụng “chiếc kéo gãy” để mang enzyme tới các điểm đặc hiệu trong hệ gen.
Nhóm đã phát hiện ra rằng việc thêm các gốc acetyl vào các protein histone đủ để làm biểu hiện tăng cường các gen được nhắm đích, xác nhận rằng hệ thống đã làm việc và, tại vị trí này, dấu ấn ngoại gen đã có tác động. Gersbach dự báo rằng một làn sóng các báo cáo sắp tới sẽ cho thấy một tác động tổng lực khi mà nhiều dấu ấn ngoại gen được tác động cùng lúc.
Các công cụ cần được tinh chỉnh. Hàng chục loại enzyme có thể tạo nên hoặc xóa đi một dấu chuẩn ngoại gen trên DNA, và không phải tất cả chúng đều phù hợp với phương pháp broken scissors.
“Nó bỗng dưng trở nên khó khăn hơn so với nhiều người dự đoán,” Gersbach nói. “Bạn gắn rất nhiều thứ vào một Cas9 đã chết (mất khả năng cắt) và chúng không hoạt động.” Đôi khi thật khó để suy xét liệu một kết quả không mong đợi phát sinh bởi một phương pháp không hoạt động tốt, hay bởi dấu ấn ngoại gen đơn thuần không có ý nghĩa trong loại tế bào hay trong môi trường nhất định.
Rots đã khám phá ra chức năng của dấu ấn ngoại gen trên các gen liên quan ung thư sử dụng các công cụ chỉnh sửa gen cũ hơn, được gọi là zinc-finger protein và giờ là hệ thống CRISPR Cas9. Các công cụ mới đã phổ cập hóa lĩnh vực này, bà nói, và nó đã tạo ra một tầm ảnh hưởng rộng. Mọi người từng nói rằng những mối liên hệ chỉ là ngẫu nhiên, bà Rots nói – vậy nếu bạn viết lại di truyền ngoại gen thì nó sẽ không có tác động lên sự biểu hiện gen nữa. “Nhưng giờ đây, không còn khó khăn gì để kiểm chứng điều đó, rất nhiều người đang tham gia vào lĩnh vực này rồi.”
CRISPR CODE CRACKING – THĂM DÒ CÁC VÙNG KHÔNG MÃ HÓA
Dấu ấn di truyền ngoại gen trên DNA không phải là mã di truyền duy nhất từng bị phá vỡ. Hơn 98% hệ gen người không mã cho protein. Nhưng các nhà nghiên cứu nghĩ rằng một phần nhỏ trong DNA này đang làm gì đó quan trọng, và họ đang phát triển kỹ thuật CRISPR Cas9 để xác định nó là gì.
Một phần trong đó mã hóa các phân tử RNA – như là microRNA và RNAs dài không mã hóa – được cho là có các chức năng khác, không tạo protein. Các trình tự khác là các trình tự tăng cường (enhancer) giúp khuếch đại mức độ biểu hiện của các gen dưới lệnh của nó. Hầu hết các trình tự DNA có liên quan tới nguy cơ mắc các bệnh phổ biến là nằm trong vùng của genome chứa enhancer hay RNA không mã hóa. Nhưng trước thời đại của công nghệ CRISPR-Cas9, rất khó để các nhà nghiên cứu xác định các trình tự này đảm nhận điều gì. “Chúng tôi không có một cách hợp lý nào để chú giải về mặt chức năng cho phần genome không mã hóa kia,” theo Bauer. “Giờ đây các thí nghiệm của chúng tôi đã tinh vi hơn nhiều.”
Farnham và các cộng sự của bà đang sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để xóa đi các vùng tăng cường được phát hiện là đột biến trong các nghiên cứu hệ gen người ung thư tuyến tiền liệt và ung thư đại tràng. Các kết quả đôi khi đã khiến bà ngỡ ngàng. Trong một thí nghiệm không được công bố, nhóm của bà đã xóa một enhancer, vùng được cho là quan trọng, nhưng vẫn chưa có gen nào trong phạm vi một triệu bazo quanh nó bị thay đổi biểu hiện. “Cách chúng tôi phân loại độ mạnh của một yếu tố điều hòa không tương ứng với việc điều gì xảy ra khi bạn xóa đi yếu tố đó,” bà nói.
Nhiều bất ngờ có thể còn được lưu trữ khi các nhà khoa học khai thác kỹ thuật CRISPR-Cas9 để thăm dò các đoạn DNA điều hòa lớn. Các nhóm dẫn đầu bởi nhà di truyền David Gifford tại viện MIT và Richard Sherwood tại bệnh viện Brigham and Women, Boston đã sử dụng kỹ thuật tạo ra các đột biến trong một trình tự 40.000 ký tự và kiểm tra xem thay đổi nào có ảnh hưởng đối với hoạt động của gen nằm cạnh dựa vào protein phát huỳnh quang. Kết quả là một bản đồ các trình tự DNA ứng với sự biểu hiện gen được tăng cường, bao gồm một số gen trước đó không được dự đoán trên cơ sở các đặc điểm điều hòa gen, như là biến đổi chromatin.
Nghiên cứu sâu vào vùng bí ẩn này có những thách thức, thậm chí là với CRISPR-Cas9. Enzyme Cas9 sẽ cắt ở nơi mà gRNA bảo nó phải cắt, nhưng giá mà chỉ có một trình tự DNA đặc hiệu ở gần vị trí cắt. Điều này tạo ra một số khó khăn cho các nhà nghiên cứu muốn làm tắt một gen, bởi vì trình tự then chốt hầu như luôn tồn tại đâu đó bên trong nó. Nhưng những ai muốn tạo ra những thay đổi rất chính xác trên các RNA ngắn không mã hóa, lựa chọn có thể bị giới hạn.
Các nhà nghiên cứu đang chọn lọc trong giới vi khuẩn để tìm ra các họ hàng của enzyme Cas9 có thể tiếp nhận các trình tự khác nhau. Năm 2015, phòng thí nghiệm của Feng Zhang, một nhà kỹ thuật di truyền tại Viện Mở của Viện MIT và Đại học Harvard đã xác định một họ enzyme được gọi là Cpf1 hoạt động tương tự Cas9 và có thể mở rộng tùy chọn trình tự. Nhưng Agami lưu ý rằng rất ít những enzyme thay thế được tìm thấy cho đến nay cũng làm việc được như Cas9. Trong tương lai, ông hy vọng rằng có một tập hợp đầy đủ các enzyme có thể nhắm đích bất cứ vị trí nào trong hệ gen.
CRISPR SEE THE LIGHT – ĐIỀU HÒA CẢM ỨNG ÁNH SÁNG
Phòng thí nghiệm của Gersbach đang sử dụng các công cụ chỉnh sửa gen như là một phần của nỗ lực để hiểu rõ về số phận của tế bào và làm thế nào để điều khiển được nó: nhóm hy vọng rằng một ngày nào đó nuôi cấy mô trên một đĩa nuôi để dùng cho sàng lọc thuốc và liệu pháp tế bào. Nhưng tác động của CRISPR-Cas9 là vĩnh viễn, và nhóm của Gersbach cần bật tắt gen một cách tạm thời, và tại một vị trí thật đặc hiệu trong mô. “Việc thiết kế một mạch máu đòi hỏi một mức độ kiểm soát nghiêm ngặt,” ông nói.
Gersbach và cộng sự đã sử dụng chiếc kéo gãy đã được biến đổi – Cas9 lúc này có thể kích hoạt gen – và đã bổ sung thêm các protein có thể được kích hoạt bằng ánh sáng xanh. Hệ thống thu được kích hoạt biểu hiện gen khi các tế bào tiếp xúc với ánh sáng, và ngừng hoạt động khi ánh sáng tắt. Một nhóm được dẫn đầu bởi nhà hóa sinh học Moritoshi Sato tại Đại học Tokyo đã thiết kế một hệ thống tương tự, và cũng tạo ra một Cas9 hoạt động làm thay đổi hệ gen ngay sau khi nó bắt gặp ánh sáng xanh.
Các nhóm nghiên cứu khác cũng đã đạt được thành quả tương tự khi kết hợp CRISPR với một công tắc hóa học khác. Lukas Dow, một nhà di truyền học ung thư tại Weill Cornell Medical College, New York mong muốn làm đột biến các gen liên quan tới ung thư trong chuột trưởng thành, để sinh ra các đột biến như đã được xác định ở ung thư kết trực tràng (colorectal) người. Nhóm đã thiết kế hệ thống CRISPR-Cas9 trong đó hàng chục phân tử doxycycline kích hoạt Cas9, cho phép nó cắt trình tự đích.
MODEL CRISPR – MÔ HÌNH HÓA CÁC BỆNH
Nhà nghiên cứu ung thư Wen Xue đã dành những năm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu postdoc của mình để tạo ra một loại chuột chuyển gen mang một đột biến xuất hiện ở bệnh nhân ung thư gan. Ông miệt mài tạo ra công cụ cần cho việc nhắm đích gen, tiêm chúng vào các tế bào gốc phôi và sau đó cố gắng tạo ra các con chuột đột biến. Cái giá: 1 năm và 20.000 đô-la. “Đấy đúng là một bước làm chậm cả nghiên cứu các gen bệnh của tôi,” ông nói. Ít năm sau, khi ông sắp sửa bắt tay vào một thí nghiệm khác trên chuột chuyển gen, cố vấn của ông đã đề nghị thử CRISPR Cas9. Lúc này, Xue chỉ cần đặt hàng công cụ đó, tiêm chúng vào phôi chuột giai đoạn một tế bào. “Chúng tôi đã có những con chuột trong vòng một tháng,” Xue nói. “Tôi ước tôi có được công nghệ này sớm hơn, nghiên cứu postdoc của tôi hẳn sẽ ngắn hơn nhiều.”
Các nhà nghiên cứu trên mọi lĩnh vực từ ung thư tới thoái hóa thần kinh đều đang dùng hệ thống CRISPR-Cas9 để tạo ra các động vật mô hình mang bệnh. Nó cho phép họ thiết kế nhiều động vật hơn, theo những cách phức tạp hơn, và trong một phạm vi rộng các loài khác nữa. Xue, hiện đang điều hành lab của mình tại UMMS (một trong năm khuôn viên của Đại học Massachusetts) đang chọn lọc có hệ thống toàn bộ dữ liệu từ các hệ gen ung thư, sử dụng CRISPR-Cas9 để xây dựng mô hình các đột biến trong tế bào nuôi cấy cũng như trên động vật. Các nhà nghiên cứu đang hy vọng kết hợp các công cụ CRISPR Cas9 mới để thao tác một cách chính xác trên hệ gen và hệ di truyền ngoại gen ở động vật mô hình. “Sức mạnh thực sự sẽ là sự tích hợp các hệ thống này,” Dow nói. Điều này có thể cho phép các nhà khoa học hiểu được một số trong những bệnh phức tạp phổ biến ở người.
Ung thư có thể chứa đựng hàng chục đột biến có tiềm năng đóng góp vào sự phát triển khối u. “Không phải tất cả chúng đều quan trọng về khía cạnh mô hình hóa một khối u,” theo Dow. “Nhưng rất rõ ràng rằng bạn sắp phải cần hai đến bốn đột biến để thiết lập mô hình thực sự cho sự tiến triển bệnh và đến gần hơn với việc mô hình hóa bệnh ung thư.” Gây tất cả các đột biến này trên một con chuột là cách cổ điển thực sự đắt đỏ và tốn thời gian.
Nhà kỹ thuật sinh học Patrick Hsu đã gây dựng lab của mình tại Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, California hồi năm 2015; mục đích của ông là sử dụng chỉnh sửa gen để xác định mô hình các trường hợp thoái hóa thần kinh như là bệnh Alzheimer hay Parkinson trên tế bào nuôi cấy và khỉ đuôi sóc. Điều này có thể liên hệ sang hành vi của con người và sự tiến triển của bệnh một cách hiệu quả hơn so với mô hình chuột, nhưng nó đắt không tưởng và chậm so với CRISPR Cas9. Ngay cả khi ông thiết kế các thí nghiệm để biến đổi di truyền những con khỉ sóc CRISPR đầu tiên, Hsu nhận thức được rằng phương pháp này chỉ là một bước để đến phương pháp tiếp theo. “Công nghệ có thể thay đổi. Bạn không thể mãi chọn lựa một thứ,” ông nói.
Hình minh họa cho các hướng đi trên: HACKING CRISPR
Những biến đổi từ hệ thống CRISPR Cas9 ban đầu
Bài viết của HEIDI LEDFORD trên NATURE|News Feature (Nature 531, 156–159 (10 March 2016) doi:10.1038/531156a)
Đọc thêm:
Iceberg (biên tập)
Tapchisinhhoc.com
No Responses