Giải trình tự Sanger là gì?
Giải trình tự Sanger là công nghệ giải trình tự ADN đầu tiên được tạo ra bởi Tiến sĩ Frederick Sanger vào những năm 1970, người thường được coi là ‘cha đẻ của bộ gen’ và đã nhận được giải thưởng Nobel năm 1980 cho phát minh mang tính đột phá của mình .
Công nghệ giải trình tự này còn được gọi là phương pháp chấm dứt chuỗi, hoạt động theo cách thức được mô tả như dưới đây.
Công nghệ giải trình tự Sanger cơ bản
Để chuẩn bị ADN mục tiêu cho việc giải trình tự, trước tiên nó được chia thành các đoạn ngắn được biến tính thành hai đoạn ADN chuỗi đơn (ssDNA) và một chuỗi ADN ngắn hơn gọi là mồi liên kết với ssDNA thông qua ghép cặp bazơ bổ sung (Hình 1A).
Tiếp theo, DNA polymerase (DNAP) bổ sung deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) vào dung dịch liền kề với mồi dựa trên sự bổ sung và quá trình này tiếp tục cho đến khi đến cuối ssDNA.
Phản ứng này xảy ra trong bốn ống phản ứng khác nhau, trong đó mỗi ống cũng chứa một trong bốn biến thể kết thúc chuỗi của dNTP được gọi là dideoxynucleotide (ddNTP) (Hình 1B).
Bất cứ khi nào ddNTP được kết hợp vào chuỗi kéo dài, DNAP không thể kéo dài chuỗi ADN nữa, quá trình sẽ kết thúc.
Và vì có nhiều chuỗi ADN khác nhau được kéo dài và kết thúc trong cùng một ống nghiệm nên bạn sẽ thu được các đoạn ADN có độ dài và trọng lượng phân tử khác nhau do sự kết hợp của ddNTP ở mỗi vị trí nucleotide trên đoạn DNA.
Điều quan trọng cần lưu ý là các ddNTP này được dán nhãn bằng các phân tử phóng xạ, điều này rất quan trọng để nhận dạng vì mỗi loại ddNTP có mức phát xạ phóng xạ riêng.
Sau khi phản ứng hoàn tất, các đoạn ADN sẽ được điện di trên gel để phân tách các đoạn ADN đã kết thúc theo kích thước, trong đó các chuỗi ngắn nhất di chuyển qua gel nhanh nhất (Hình 1C).
Sau đó, toàn bộ gel được đặt dưới tia X hoặc tia UV để có thể nhìn thấy được các ddNTP được đánh dấu phóng xạ.
Tiếp theo, bằng cách di chuyển gel lên trên và ghi lại ddNTP theo trình tự, các nhà khoa học có thể thu được trình tự của phân tử ADN mục tiêu (Hình 1C).
Với công nghệ rất hạn chế hiện có vào thời điểm đó, độ chính xác, mạnh mẽ và dễ sử dụng đã khiến Sanger’s Sequencing trở thành một trong những công nghệ giải trình tự ADN phổ biến nhất được sử dụng trong nhiều năm tới.
Hình 1 : Công nghệ giải trình tự Sanger.
A. ADN mục tiêu bị phân mảnh, khuếch đại, biến tính và liên kết với mồi.
B. Bốn hỗn hợp phản ứng chứa các ddNTP được đánh dấu phóng xạ khác nhau, nơi diễn ra quá trình kéo dài và kết thúc.
C. Điện di trên gel để phân tách các mảnh đã kết thúc theo kích thước.
Tự động hóa quy trình giải trình tự Sanger
Theo nguyên tắc tương tự và sau khi hoàn thành phản ứng kết thúc chuỗi, tất cả các thành phần của ống nghiệm này đều được điện di trên gel, phân tách các phân tử ADN kết thúc khác nhau tùy theo kích thước (Hình 2A).
Trong biến thể cải tiến của công nghệ giải trình tự Sanger này, quá trình điện di trên gel xảy ra trong ống mao quản, một khía cạnh quan trọng khác của tự động hóa (Hình 2B).
Ở phía cuối ống mao dẫn, có một tia laser kích thích fluorophore được tích hợp vào sợi kéo dài của phân tử ADN để tạo ra một đỉnh được ghi trên biểu đồ (Hình 2C).
Kết quả là, điều này cho phép các nhà khoa học thu được toàn bộ chuỗi ADN sau khi tất cả các đoạn ADN đã kết thúc đã đi qua tia laser.
Hình 2 : Công nghệ giải trình tự Sanger tự động.
A. DNA mục tiêu bị phân mảnh, khuếch đại, biến tính và liên kết với mồi.
B. Quá trình kéo dài xảy ra trong một hỗn hợp phản ứng đơn lẻ trong đó việc bổ sung ddNTP có đánh dấu huỳnh quang sẽ dẫn đến sự kết thúc.
C. Điện di trên gel mao quản để phân tách các mảnh đã kết thúc theo kích thước và kích thích bằng laser để phát hiện.
Ý nghĩa của công nghệ giải trình tự Sanger
Lần đầu tiên, giải trình tự Sanger đã cho phép các nhà khoa học sắp xếp trình tự ADN có nguồn gốc từ nhiều sinh vật, điều này đã cải thiện sự hiểu biết của chúng ta về mầm bệnh, nguồn gốc của bệnh tật và thế giới xung quanh chúng ta.
Bất chấp những gì đã đạt được, độ chính xác đáng kể và tính sẵn có rộng rãi của nó đã bị lu mờ bởi một số hạn chế nổi bật đã cản trở việc sử dụng nó trong các ứng dụng hiện đại.
Điều này bao gồm cách thức trình tự được tạo ra bắt nguồn từ một phản ứng giải trình tự đơn lẻ, cũng như hạn chế rằng các đoạn ADN được giải trình tự phải dài dưới 1000 nucleotide, bên cạnh thực tế là quá trình này tốn nhiều công sức và thời gian.
Kết quả là, giải trình tự Sanger đã trải qua nhiều lần nâng cấp để cải thiện và theo kịp sự cạnh tranh, đó là lý do tại sao quy trình tự động này vẫn được sử dụng cho đến ngày nay bởi Thermo Fisher Scientific.
Tuy nhiên, nhiều thế hệ công nghệ giải trình tự ADN mới hơn phần lớn đã vượt qua giải trình tự Sanger.
Dù sao đi nữa, điều này không làm mất uy tín thực tế rằng công nghệ giải trình tự ADN thế hệ đầu tiên này đã mở đường cho các làn sóng công nghệ giải trình tự tiên tiến tiếp theo đã cách mạng hóa y học.
*** Xem thêm:
- Nguyên lý giải trình tự thế hệ mới
- Giải trình tự DNA nanopore
