Home
Thiết kế và tối ưu hóa xét nghiệm PCR
PCR

Thiết kế và tối ưu hóa xét nghiệm PCR

30/09/2023

xét nghiệm pcr

Tổng quan xét nghiệm PCR

Xét nghiệm PCR được thiết kế và tối ưu hóa tốt sẽ mang lại độ đặc hiệu và hiệu suất cao nhất. Cần cân nhắc đặc biệt khi thực hiện các xét nghiệm PCR nhanh để tăng thông lượng và khi khuếch đại các mẫu dài. Bài viết này đề cập đến việc thiết kế và tối ưu hóa xét nghiệm PCR điểm cuối. Cần cân nhắc thêm cho việc thiết kế các xét nghiệm PCR thời gian thực .

Thiết kế mồi cho xét nghiệm PCR

Một xét nghiệm PCR thành công đòi hỏi phải khuếch đại sản phẩm một cách hiệu quả và đặc hiệu.

Cả mồi và trình tự đích đều có thể ảnh hưởng đến hiệu quả, độ đặc hiệu và độ chính xác của xét nghiệm PCR.

Vì vậy, phải cẩn thận khi lựa chọn trình tự mục tiêu và thiết kế mồi. Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng các mồi PCR được thiết kế và xác nhận đặc biệt cho các xét nghiệm PCR với mục tiêu quan tâm của bạn.

Khi thiết kế mồi cho xét nghiệm PCR, hãy làm theo các bước sau:

  1. Kiểm tra tài liệu và cơ sở dữ liệu về các đoạn mồi hiện có.
  2. Chọn một chuỗi mục tiêu.
  3. Thiết kế mồi.
  4. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi.
  5. Đánh giá đặc tính mồi (nhiệt độ nóng chảy [T m ], cấu trúc thứ cấp, tính bổ sung).
  6. Xác định đặc tính sản phẩm PCR
  7. Tối ưu hóa quy trình.

Một số tài nguyên trực tuyến miễn phí có sẵn để giúp bạn thiết kế xét nghiệm PCR. Các chương trình có sẵn trên thị trường như phần mềm Beacon Designer có thể thực hiện cả thiết kế mồi và lựa chọn trình tự mục tiêu.

Lựa chọn trình tự mục tiêu

Khi khuếch đại bất kỳ trình tự nào trong một đoạn ADN nhất định cho các mục đích như thí nghiệm kiểu gen, hãy làm theo các nguyên tắc sau để chọn sản phẩm. Xem hướng dẫn trong phần Xét nghiệm PCR dài khi khuếch đại chuỗi dài.

  • Lập kế hoạch khuếch đại sản phẩm 75–200 bp. Mặc dù các sản phẩm PCR ngắn thường được khuếch đại với hiệu suất cao hơn các sản phẩm PCR dài hơn, nhưng sản phẩm PCR phải có ít nhất 75 bp để dễ dàng phân biệt với bất kỳ chất dimer mồi nào có khả năng hình thành.
  • Khi có thể, hãy tránh những vùng có cấu trúc thứ cấp. Sử dụng các chương trình như mfold để dự đoán liệu sản phẩm PCR có hình thành bất kỳ cấu trúc thứ cấp nào ở nhiệt độ ủ hay không.
  • Tránh các khu vực có sự lặp lại dài (>4) của các cơ sở đơn lẻ.
  • Chọn vùng có hàm lượng GC từ 50–60%

Thiết kế mồi

Khi thiết kế mồi cho xét nghiệm PCR, hãy làm theo các hướng dẫn sau:

  • Thiết kế mồi có hàm lượng GC từ 50–60%.
  • Phấn đấu đạt nhiệt độ Tm trong khoảng từ 50 đến 65°C. Một cách để tính giá trị T m là sử dụng phương pháp lân cận gần nhất (sử dụng công cụ tính toán T m trực tuyến này ).
  • Tránh cấu trúc thứ cấp; điều chỉnh vị trí mồi sao cho chúng nằm bên ngoài cấu trúc thứ cấp trong chuỗi mục tiêu, nếu cần.
  • Tránh lặp lại G hoặc C dài hơn 3 bazơ.
  • Đặt G và C vào đầu của trình tự mồi.
  • Kiểm tra trình tự mồi xuôi và mồi ngược để đảm bảo không có sự bổ sung 3′ (tránh hình thành mồi-dimer).
  • Xác minh tính đặc hiệu bằng cách sử dụng các công cụ như ( Công cụ xác định tính đặc hiệu cơ bản như BLAST).

Tối ưu hóa “gradient” cho xét nghiệm PCR

Tối ưu hóa nhiệt độ ủ của xét nghiệm PCR là một trong những thông số quan trọng nhất đối với độ đặc hiệu của phản ứng.

Việc đặt nhiệt độ ủ quá thấp có thể dẫn đến khuếch đại các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Mặt khác, việc cài đặt nhiệt độ ủ quá cao có thể làm giảm hiệu suất thu được sản phẩm PCR mong muốn.

Ngay cả sau khi tính toán T m của trình tự mồi, bạn có thể cần phải xác định nhiệt độ ủ theo kinh nghiệm.

Điều này liên quan đến việc lặp lại một phản ứng ở nhiều nhiệt độ khác nhau. Các thử nghiệm tốn thời gian tương tự cũng có thể được yêu cầu để tối ưu hóa nhiệt độ biến tính.

Nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho một xét nghiệm có thể được xác định dễ dàng bằng cách sử dụng các thiết bị PCR có tính năng gradient nhiệt.

Tất cả các máy chu trình nhiệt như của Bio-Rad đều có tính năng chuyển màu. Tính năng gradient cho phép bạn kiểm tra đồng thời nhiều phạm vi nhiệt độ, tối ưu hóa nhiệt độ ủ trong một thử nghiệm duy nhất.

Để tìm ra nhiệt độ ủ tối ưu cho phản ứng của bạn, hãy kiểm tra một phạm vi nhiệt độ trên và dưới T m tính toán của mồi. Phân tích kết quả bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Nếu xảy ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu, các dải bổ sung sẽ xuất hiện trên gel. Nhiệt độ ủ tối ưu là nhiệt độ mang lại năng suất cao nhất mà không có sự khuếch đại không đặc hiệu. Một thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ ủ mẫu được thể hiện trong Hình 1.

Nếu không đạt được kết quả khả quan ở bất kỳ nhiệt độ ủ nào thì phải thực hiện các bước tối ưu hóa bổ sung và có thể cần phải thiết kế lại trình tự mồi.

tối ưu hóa gradient của xét nghiệm pcr

Hình 1: Tối ưu hóa gradient của xét nghiệm PCR (Nguồn: Bio-Rad)
Tất cả các phản ứng được đánh giá trong một lần chạy. Bốn bộ mồi khác nhau (A, B, C và D) đã được thiết kế và thử nghiệm khả năng khuếch đại. Mũi tên chỉ nhiệt độ ủ mang lại độ đặc hiệu cao nhất trong khi vẫn duy trì năng suất tốt. Hộp màu vàng biểu thị nhiệt độ tối ưu. M, điểm đánh dấu; Tm , nhiệt độ nóng chảy.

Xét nghiệm PCR nhanh

Một số tiến bộ trong PCR đã làm giảm đáng kể thời gian của phản ứng khuếch đại PCR.

Việc tối ưu hóa các đoạn mồi và quy trình, việc sử dụng các polymerase có khả năng xử lý cao và các máy quay vòng nhiệt nhanh đang cho phép các nhà nghiên cứu thu được các khuếch đại có độ đặc hiệu cao trong khoảng thời gian ngắn.

Các quy trình chạy nhanh được tối ưu hóa có thể rút ngắn thời gian phản ứng PCR khoảng 1 giờ.

Rút ngắn thời gian chạy PCR

Có một số cách có thể rút ngắn thời gian chạy PCR. Có thể đạt được mức giảm đáng kể nhất về thời gian chạy bằng cách sử dụng quy trình sửa đổi với enzyme và hỗn hợp siêu lọc tương thích với thời gian phản ứng nhanh hơn.

DNA polymerase đã được thiết kế để tăng tốc độ và khả năng xử lý. Hơn nữa, các enzyme khởi động nóng đã được sửa đổi để cần ít thời gian hơn cho quá trình kích hoạt qua trung gian nhiệt độ.

Máy chu trình nhiệt có tốc độ tăng tốc nhanh hơn cũng góp phần tạo ra PCR nhanh, mặc dù sự khác biệt về tốc độ tăng tốc của máy chu trình nhiệt có tác động nhỏ hơn so với sửa đổi quy trình.

Sửa đổi quy trình PCR để có thời gian chạy nhanh hơn

Có một số cách để sửa đổi quy trình PCR để có thời gian chạy nhanh hơn. Để sửa đổi giao thức của bạn để đạt được mục tiêu nhanh hơn <250 bp:

  • Chọn mồi có nhiệt độ ủ cao hơn (chẳng hạn như 65–70°C, được tính toán bằng cách sử dụng các giá trị nhiệt động lực học của phân tử gần nhất Santa Lucia).
  • Chọn enzyme Hot-Start yêu cầu thời gian kích hoạt tối thiểu (chẳng hạn như enzyme Hot-Start qua trung gian kháng thể).
  • Tối ưu hóa nhiệt độ biến tính thấp hơn.
  • Kết hợp các bước ủ và mở rộng thành một bước duy nhất.

Xét nghiệm PCR dài

Nhân bản gen và các ứng dụng tiếp theo khác thường yêu cầu khuếch đại chính xác các đoạn ADN dài.

Việc khuếch đại thành công các vùng axit nucleic lớn hơn 3 kb đòi hỏi phải cân nhắc đặc biệt khi thiết kế xét nghiệm PCR dài (long PCR assay).

Việc khuếch đại các đoạn ADN dài mang đến những thách thức bổ sung do khả năng kết hợp sai bazơ tăng lên. Việc xuất hiện các lỗi cặp bazơ trong quá trình kéo dài sợi làm chậm đáng kể hoặc dừng hoàn toàn quá trình trùng hợp DNA.

Độ chính xác thấp của Taq polymerase khiến enzyme này không phù hợp với hầu hết các quá trình khuếch đại PCR dài.

Việc sử dụng DNA polymerase với khả năng hiệu đính trong các xét nghiệm PCR dài làm tăng đáng kể hiệu quả khuếch đại.

Enzym hiệu đính có hoạt tính exonuclease 3′ → 5′, cho phép enzyme loại bỏ một bazơ không hợp nhất và tiếp tục kéo dài.

Khả năng xử lý tương đối thấp của các enzyme hiệu đính truyền thống đã khiến các nhà nghiên cứu sử dụng Taq và các polymerase hiệu đính kết hợp hoặc sử dụng các polymerase hiệu đính được thiết kế để mang lại tốc độ trùng hợp cao hơn.

Chất lượng của mẫu ADN cũng đóng một vai trò quan trọng trong các xét nghiệm PCR kéo dài. Việc khuôn mẫu tiếp xúc với nhiệt độ cao có thể dẫn đến quá trình khử purin DNA (loại bỏ adenine hoặc guanine khỏi đường deoxyribose trên cơ sở DNA).

Độ dài của mẫu được sử dụng trong PCR dài làm tăng khả năng khử purin. Có thể giảm khả năng khử purin của ADN bằng cách rút ngắn thời gian ủ nóng cho bước biến tính xuống còn khoảng 10 giây.

ADN sợi dài cũng có xu hướng hình thành các cấu trúc thứ cấp có thể ức chế quá trình khuếch đại. Tối ưu hóa cẩn thận nồng độ dimethyl sulfoxide (DMSO) có thể giúp giảm bớt các cấu trúc thứ cấp này bằng cách phá vỡ quá trình ghép đôi cơ sở ADN.

Tài nguyên MIỄN PHÍ cho thiết kế mồi

Kiểm tra các mồi PCR hiện có

Lựa chọn trình tự mục tiêu

Thiết kế mồi

Thiết kế mồi cho PCR phiên mã ngược (RT-PCR)

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi

Đánh giá đặc điểm của trình tự mồi

Đánh giá đặc điểm sản phẩm PCR

  • UNAFold (The RNA Institute, State University of New York at Albany)

(*) Theo Bio-Rad

5/5 - (9 votes)

Related Articles

Tags:

Leave a Reply