Kỹ thuật Western Blot (Fluorescent Western Blotting), hay còn được biết đến với tên gọi phương pháp Thẩm tách miễn dịch, là kỹ thuật phát hiện protein mạnh mẽ với nhiều ưu điểm hơn so với các hệ thống phát hiện protein bằng chất phát quang hoặc chất tạo màu thay thế.
Quy trình Western Blot tạo ra ít chất thải hóa học hơn, nhanh hơn và có độ tin cậy cao hơn cho các mục đích thu thập dữ liệu về định lượng protein.
Ngoài ra, những tiến bộ trong công nghệ đã làm tăng độ nhạy của kỹ thuật, cũng như giảm chi phí. Hơn nữa, kỹ thuật này có thể được sử dụng để phát hiện nhiều protein đồng thời và vì những lý do này, phương pháp Fluorescent Western Blotting đang ngày càng phổ biến trong các phòng thí nghiệm về Sinh học phân tử.
Nguyên lý của kỹ thuật Western Blot
Để phát hiện sự hiện diện của các protein cụ thể, hệ thống Western Blot tạo ra phức hợp kháng nguyên-kháng thể, giống như các phương pháp phát hiện protein bằng so màu và phát quang hóa học thay thế.
Tuy nhiên, thay vì tạo ra các tín hiệu như là sản phẩm của phản ứng enzyme-cơ chất như trong các phương pháp so màu và hóa phát quang, thì ngược lại, phương pháp Fluorescent Western Blotting thu tín hiệu ở dạng ánh sáng.
Mỗi fluorophore, bản chất là một phân tử huỳnh quang, tạo ra sự phát xạ ánh sáng nhất thời khi nó giải phóng các photon khi trở lại trạng thái kích thích sau khi bị kích thích.
- Quá trình này bao gồm việc tách các protein cụ thể thông qua điện di và cố định chúng trên màng thấm, chuẩn bị cho bước phân tích tiếp theo.
- Việc phát hiện protein sau đó đạt được bằng cách thêm thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), chất này được kích thích bằng cách cho nó tiếp xúc với nguồn ánh sáng thích hợp.
- Ánh sáng ở bước sóng thích hợp được thuốc nhuộm hấp thụ, kích thích phân tử huỳnh quang, giải phóng các photon khi nó trở về trạng thái điện tử cơ bản.
- Sau đó, một thiết bị chụp ảnh kỹ thuật số được sử dụng để phát hiện ánh sáng phát ra, khẳng định sự hiện diện của phân tử protein có mặt trong dung dịch mẫu nghiên cứu.
Tối ưu hóa cũng là một giai đoạn quan trọng của hệ thống Fluorescent Western Blotting, giống như với các phương pháp dựa trên phản ứng enzyme thay thế. Mức độ gắn với huỳnh quang phải vừa phải để tạo ra mức tín hiệu tối ưu: nếu quá ít thì tín hiệu quá yếu và nếu quá nhiều thì tín hiệu lại quá yếu do thuốc thử phát hiện bị vô hiệu hóa.
Cuối cùng, các nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Western Blot cần phải dành sự xem xét đặc biệt về vật liệu mà họ chọn làm màng.
Một số loại màng dùng cho điện di protein, chẳng hạn như nitrocellulose và poly-vinylidene Difluoride (PVDF), bản thân chúng cũng có đặc tính huỳnh quang.
Việc sử dụng các vật liệu màng này trong kỹ thuật Western Blot huỳnh quang sẽ tạo ra các tín hiệu nền làm giảm khả năng đọc dữ liệu thực.
Để giải quyết vấn đề này, các thuốc thử cụ thể đã được tạo ra để sử dụng trong phương pháp Fluorescent Western Blotting, những thuốc thử có bước sóng kích thích và phát xạ nhất định làm giảm khả năng tự phát huỳnh quang từ các màng thông thường. Ngoài ra, các màng huỳnh quang thấp cụ thể cũng đã được tạo ra để giải quyết vấn đề này.
Phân tích dữ liệu Western Blot
Sau khi chạy điện di protein xong, các thiết bị chụp ảnh huỳnh quang đặc biệt sẽ được sử dụng để đọc và ghi lại ánh sáng phát ra.
Thiết bị chụp ảnh huỳnh quang thường có dạng dụng cụ chiếu sáng, nguồn sáng dựa trên tia laser hoặc đèn LED và bộ lọc đảm bảo rằng bước sóng ánh sáng chính xác được đưa đến mẫu, cũng như cho phép thu được bước sóng cần thiết trong sản lượng phát thải.
Các công cụ hiện tại chủ yếu sử dụng máy ảnh dựa trên thiết bị ghép điện tích (CCD) để ghi lại tín hiệu, nghĩa là dữ liệu có sẵn ở định dạng kỹ thuật số.
Vì kỹ thuật Western Blot có khả năng phát hiện đa kênh, cho phép xác định đồng thời nhiều protein mục tiêu, nên cần có thêm các công cụ để phân tích nhiều loại thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các phân tử protein mục tiêu riêng biệt. Thông thường nhất, các công cụ trực tuyến được sử dụng để hỗ trợ lựa chọn bảng điều khiển để phát hiện huỳnh quang đa kênh.
Ưu điểm của kỹ thuật Western Blot
Phương pháp phát hiện protein bằng huỳnh quang có một số ưu điểm so với các phương pháp phát hiện dựa trên enzyme thay thế. Những lợi ích này đang giúp thiết lập Western Blot như một phương pháp phát hiện protein ngày càng phổ biến.
Như đã đề cập ở phần trên, việc phát hiện nhiều protein có thể dễ dàng đạt được bằng phương pháp Western blot huỳnh quang. Chỉ từ một đốm đơn lẻ, nhiều protein có thể được phát hiện cùng lúc bằng cách sử dụng các thuốc nhuộm khác biệt về mặt quang phổ phát ra ánh sáng ở bước sóng đặc trưng, cho phép nghiên cứu nhiều mục tiêu mà không cần thử nghiệm riêng biệt.
Phương pháp này cũng được coi là thành công trong việc cung cấp dữ liệu định lượng đáng tin cậy. Người ta đã thấy rằng mức độ tín hiệu được tạo ra tỷ lệ thuận với khối lượng protein trong mẫu. Có thể xác định chính xác các protein có nhiều hoặc chỉ phân tán thưa thớt trong một mẫu, mang lại sức mạnh cho phương pháp phát hiện định lượng. So với các hệ thống enzyme thay thế, phương pháp Western blot có thể cho biết nhiều dữ liệu định lượng hơn.
Ngoài ra, phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm thời gian của nhà nghiên cứu. Nó có thể làm điều này theo nhiều cách. Thứ nhất, bởi vì nó có thể phát hiện nhiều protein mục tiêu chỉ từ một mẫu blot, thay vì tiến hành nhiều thử nghiệm. Thứ hai, bởi vì với loại thử nghiệm này, không cần phân bổ thời gian để ủ chất nền hoặc phơi phim.
Ngoài ra, việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang đặc biệt đã được chứng minh là có độ nhạy cao, đó cũng là cơ sở để phát triển một phương pháp phát hiện protein mạnh mẽ. Do khả năng tự phát huỳnh quang nền thấp, khả năng dập tắt huỳnh quang thấp và hệ số tắt cao, các liên hợp thuốc nhuộm huỳnh quang hồng ngoại và đỏ xa dẫn đến độ nhạy phát hiện cao hơn.
Tổng kết lại, kỹ thuật Western Blot đã từng bước cho thấy đây là một phương pháp phát hiện protein mạnh mẽ vì kỹ thuật này mang lại nhiều lợi ích so với các phương pháp thay thế, chẳng hạn như khả năng phát hiện nhiều protein đồng thời, độ nhạy cao và quy trình tiết kiệm thời gian. Kết quả là nó đang trở thành một kỹ thuật ngày càng phổ biến để phát hiện protein.
