Nội dung
Western blot troubleshooting – khắc phục vấn đề với Western blot
Trong bài viết về Western Blot Troubleshooting này, chúng tôi sẽ giúp bạn xác định một cách trực quan các vấn đề cụ thể và phổ biến khi làm Western blot, chẳng hạn như tín hiệu nền cao, tín hiệu yếu hoặc không có, nhiều dải màu, nhuộm không đều; gợi ý một số nguyên nhân có thể gây ra cho các hiện tượng và một số giải pháp khắc phục chúng .
Xem thêm:
Khắc phục vấn đề với điện di protein
Các băng protein độ phân giải kém, các băng bị sọc và đường chạy không thẳng
Nguyên nhân: Quá nhiều protein trong một giếng
Giải pháp: Giảm lượng protein vào giếng. Lượng nạp mẫu tối đa được khuyến nghị để có độ phân giải tối ưu (với gel 10, 12, 15, 17 giếng) là 0.5 μg/giếng hoặc 10 – 15 ug dịch ly giải tế bào mỗi giếng.
Các mẫu sệt, các sọc ở rìa các băng, băng hình quả tạ và đường chạy loe dần
Nguyên nhân: Quá nhiều muối (amoni sulfate) trong mẫu trong quá trình điện di
Giải pháp: Thẩm tác để giảm nồng độ muối. Có thể tham khảo các dụng cụ thẩm tách protein từ các hãng uy tín.
Cô đặc và pha lại mẫu trong đệm với nồng độ muối thấp hơn trước khi điện di. Có máy cô đặc dung tích nhỏ cho các bạn thảm khảo.
Đảm bảo nồng độ muối không quá 100 mM nhé.
Protein tụ lại làm đường chạy nhỏ dần, không thể phân tách được
Nguyên nhân: Nhiễm DNA. DNA hệ gen trong dịch ly giải tế bào có thể làm cho mẫu trở nên sệt nhớ, khiến protein dễ tụ lại, ảnh hưởng đến cách di chuyển và sự phân giải protein.
Giải pháp: phân giải DNA hệ gen trước khi điện di protein.
Các đường chạy thất thường, đường chạy loe dần
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Quá nhiều muối (sodium chloride) trong mẫu trong lúc điện di. Nồng độ muối quá cao làm tăng độ dẫn điện, ảnh hưởng đến sự di động của protein và có thể làm các băng protein loe rộng và chèn ép các đường chạy bên cạnh mang nồng độ muối bình thường. | – Thực hiện thẩm tách để giảm nồng độ muối. – Cô đặc và pha lại mẫu trong đệm với nồng độ muối thấp hơn trước khi điện di. Có máy cô đặc dung tích nhỏ cho các bạn thảm khảo. – Đảm bảo nồng độ muối không quá 100 mM. |
| Nồng độ cao của chất tẩy rửa (như Triton X-100) trong điện di. Các chất hình thành micelle cố định với SDS mang điện âm trong gel và di chuyển xuống bản gel; chúng ảnh hưởng đến cân bằng liên kết SDS – protein. | – Hầu hết các chất tẩy rửa không ion (Triton X-100, NP-40, và Tween 20) ảnh hưởng đến điện di SDS – PAGE. Hãy kiềm chế tỉ lệ của SDS so với các chất tẩy rửa không ion là 10:1 hoặc cao hơn. – Sử dụng các cột lọc loại bỏ chất tẩy còn quá nhiều hoặc kit tinh sạch. |
| Nồng độ đệm quá cao trong RIPA (radioimmunoprecipitation assay) làm loe rộng giếng và băng bị sọc quá mức. | Pha loãng mẫu trước khi điện di để làm giảm nồng độ đệm ly giải nhằm ngăn chặn các vấn đề liên quan đến đệm. |
Rìa các đường chạy mờ đi
Nguyên nhân: Quá nhiều chất khử trong dịch ly giải hoặc đệm mẫu
Giải pháp: Nồng độ cuối cùng của các chất khử trong SDS – PAGE nên dưới 50 mM DTT (dithiothreitol) và TCEP (tris(2-carboxyethyl) phosphine), và ít hơn 2.5% β-ME (β-mercaptoethanol).
Khắc phục vấn đề của Western blot
Băng không đặc hiệu hoặc băng bị khuếch tán (nhòe)
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Nồng độ kháng thể quá cao | Giảm nồng độ kháng thể; đặc biệt là kháng thể sơ cấp |
| Quá nhiều protein được đưa vào gel | Giảm lượng mẫu cho vào mỗi giếng của gel |
| Tín hiệu từ cơ chất phát quang hóa học là quá mạnh | – Giảm nồng độ cơ chất – Giảm thời gian ủ của màng với cơ chất – Loại bỏ hoàn toàn cơ chất sau thời gian ủ – Giảm nồng độ kháng thể, nhất là kháng thể liên hợp HRP và AP. – Giảm thời gian phơi blot trước film chụp |
Tín hiệu nền
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Nồng độ kháng thể quá cao | Giảm nồng độ kháng thể sơ cấp hoặc thứ cấp hoặc cả hai. |
| Đệm khóa màng không phù hợp | – Đừng sử dụng sữa với hệ thống biotin – avidin. Sữa có chứa biotin, sẽ dẫn đến nền cao. – Khi muốn phát hiện phosphoprotein, tránh các đệm chứa phosphate như PBS và các tác nhân khóa màng chứa phosphoprotein như sữa hoặc casein. Thay vào đó, khóa màng bằng BSA trong đệm muối Tris. – Kiểm tra khả năng phản ứng chéo trong việc khóa màng: thử khóa một mảnh màng sạch, ủ với kháng thể và sau đó dùng cơ chất sẽ dùng để phát hiện. – Khi sử dụng kháng thể liên hợp alkaline phosphatase kiềm (AP), nên sử dụng dung dịch khóa màng pha trong muối Tris (TBS) vì dung dịch muối đệm phosphate (PBS) cản trở hoạt động của AP. – Hãy thử một bộ đệm chặn khác. Xem hướng dẫn lựa chọn đệm khóa màng tương thích nhất cho thí nghiệm của bạn. |
| Chưa hiệu quả khi khóa các vị trí không đặc hiệu | – Tăng nồng độ protein trong đệm khóa màng. – Tối ưu hóa thời gian và nhiệt độ khóa. Nên khóa màng trong ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4°C. – Thêm Tween 20 vào đệm khóa màng có thể giúp giảm tín hiệu nền. Tuy nhiên, quá nhiều chất tẩy rửa có thể cản trở liên kết kháng thể. Nồng độ cuối cùng 0,05% thường hoạt động tốt. Để dễ sử dụng, hãy chọn bộ đệm chặn đã chứa 0,05% Tween 20. Nếu gặp phải tính huống này ở mức độ nghiêm trọng, hãy tìm các đệm tối ưu bởi các hãng thương mại. – Pha loãng kháng thể trong đệm khóa màng có chứa 0,05% Tween 20. – Đến đây thì hãy nghĩ tới các sản phẩm làm tăng tín hiệu blot giúp phát hiện các kháng nguyên tín hiệu kém và giảm nền. |
| Rửa chưa hiệu quả | – Tăng số lần rửa và / hoặc lượng đệm được sử dụng. – Thêm Tween 20 vào đệm rửa đến nồng độ cuối cùng là 0,05%. Nếu nồng độ Tween 20 quá cao, nó có thể làm trôi protein khỏi màng. |
| Thao tác với màng chưa cẩn thận | – Làm ướt và kích hoạt màng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. – Luôn đeo găng tay sạch hoặc sử dụng kẹp khi xử lý màng. – Phủ màng bằng chất lỏng mọi lúc để tránh bị khô. – Dùng thiết bị lắc trộn trong tất cả các lần ủ. – Thao tác với màng cẩn thận – hư tổn đối với màng có thể gây ra liên kết không đặc hiệu. |
| Nhiễm bẩn của dụng cụ hoặc hóa chất | – Chuẩn bị đệm mới và lọc đệm trước khi sử dụng. – Chỉ sử dụng thiết bị điện di, dụng cụ blot và khay ủ sạch và không có chất gây ô nhiễm. |
| Tín hiệu từ cơ chất phát quang hóa học là quá mạnh | – Giảm nồng độ cơ chất – Giảm thời gian ủ của màng với cơ chất – Loại bỏ hoàn toàn cơ chất sau thời gian ủ – Giảm nồng độ kháng thể, nhất là kháng thể liên hợp HRP và AP. – Giảm thời gian phơi blot trước film chụp |
Tín hiệu kém hoặc không có tín hiệu
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Chuyển lên màng không hoàn toàn hoặc không hiệu quả | – Sau khi chuyển, nhuộm gel (nhuộm protein tổng số) để xác định hiệu suất chuyển màng. Có các kit để giúp các bạn đơn giản hóa và tối ưu công việc này. – Đảm bảo rằng sự tiếp xúc giữa gel và màng là tốt trong quá trình chuyển bằng một con lăn (tương tự như con lăn sơn tường) để dàn phẳng từng lớp của hệ thống chuyển – Đảm bảo rằng các lớp của hệ thống chuyển được đặt vào đúng mặt của nó, để protein có thể đi lên màng thay vì đi ra ngoài. – Làm ướt và hoạt hóa màng theo hướng dẫn của nhà sản xuất – Dùng đối chứng dương, ví dụ như maker khối lượng đã nhuộm trước, để đánh giá hiệu suất chuyển màng. – Tăng đồng thời hoặc lần lượt thời gian hoặc điện thế chuyển. – Hãy chắc chắn rằng điều kiện chuẩn bị mẫu không phá hỏng tính kháng nguyên của mẫu (vis dụ, một số protein không thể di động dưới ở trạng thái khử) |
| Bám vào màng không hiệu quả | – Đối với kháng nguyên khối lượng nhỏ, thêm 20% methanol vào đệm chuyển để tăng khả năng bám và ngăn chặn protein khỏi bị đi qua màng. – Giảm thời gian chuyển. Các kháng nguyên phân tử khối nhỏ có thể đi qua màng. – Với kháng nguyên phân tử khối lớn, thêm 0.01 – 0.05% SDS vào đệm chuyển để dễ kéo protein từ gel lên màng. – Đổi loại màng (NC – PVDF) – Chọn màng có kích thước lỗ nhỏ hơn. |
| Nồng độ kháng nguyên quá thấp | – Tăng nồng độ kháng thể. Kháng thể có thể có ái lực thấp với protein quan tâm. – Kháng thể có thể mất hoạt tính. Thực hiện một thí nghiệm lai điểm (dot blot) để khẳng định hoạt tính. |
| Kháng nguyên không đủ nhiều trong mẫu | – Điện di lượng protein lớn hơn |
| Kháng nguyên bị phủ bởi đệm khóa màng | – Giảm nồng độ protein khóa màng – Thử đệm khóa màng khác. |
| Đệm chứa Natri azit | Natri azit ức chế HRP. Đừng dùng nó với kháng thể liên hợp HRP |
| Tín hiệu từ cơ chất phát quang hóa học quá yếu | – Tăng thời gian ủ màng với cơ chất – Tăng thời gian phơi chụp phim – Đảm bảo cơ chất … còn hạn sử dụng – Khi bạn không có quá nhiều protein để thử, hãy sử dụng cơ chất lượng cao hơn (theo quảng cáo). |
| Màng đã bị tách nhiều lần hoặc lai nhiều lần | – Tránh việc tách màng lặp lại nhiều lần (cuối bước chuyển) – Giảm thời gian ủ trong đệm tách màng để hạn chế thất thoát kháng nguyên |
| Kháng nguyên trên màng bị phân hủy | – Chất khóa màng có thể có hoạt tính ly giải (vd gelatin) |
| Phân hủy protein từ những màng đã chuyển từ lâu | – Hãy chuyển lại một màng Southern blot mới |
Khắc phục vấn đề liên quan đến phát huỳnh quang
Băng không đặc hiệu hoặc băng bị khuếch tán (nhòe)
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Tính đặc hiệu của kháng thể kém | – Thử các kháng thể sơ cấp khác – Chỉ sử dụng kháng thể sơ cấp có hiệu lực với Western blot |
| Mẫu không còn nguyên vẹn | Sự phân giải của mẫu do quá nhiệt hoặc hoạt tính protease gây ra sự phát hiện khó khăn của kháng thể. Ví dụ, đừng đun sôi các mẫu dùng để chạy SDS-PAGE trong đệm SDS, mà hãy đun nóng đến 70oC trong 10 phút để tránh sự phân giải protein. |
| Hoạt tính chéo của kháng thể – kháng nguyên trong thí nghiệm phát hiện nhiều đích. | – Chọn các kháng thể sơ cấp được gây trong các vật chủ không có họ hàng gần gũi. – Sử dụng kháng thể thứ cấp đặc hiệu cao cross-adsorbed secondary antibodies) không có hoạt tính tương tác chéo với kháng nguyên khác. – Giảm lượng kháng thể thứ cấp, chỉ duy trì ở mức hoạt động tối ưu |
| Tín hiệu huỳnh quang từ một kênh khác trong thí nghiệm phát hiện nhiều đích (xuất hiện băng không mong muốn) | – Tránh các liên hợp gần nhau về mặt quang phổ, đặc biệt là khi tín hiệu rất mạnh. – Đảm bảo rằng các thuốc nhuộm huỳnh quang có thể được phân biệt rạch ròi trên thiết bị chụp ảnh của bạn. – Sử dụng tính năng tự động phơi sáng trên thiết bị để xác định thời gian phơi sáng tối ưu cho mỗi kênh |
Tín hiệu yếu hoặc không có
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Độ đặc hiệu của kháng thể với đích là thấp | -Tăng nồng độ kháng thể sơ cấp – Đảm bảo kháng thể sơ cấp có hàm lượng tốt và đặc hiệu với kháng nguyên cần phát hiện – Với đích không có hàm lượng cao trong dịch ly giải, tăng lượng kháng thể sơ cấp hoặc lượng mẫu đưa lên gel – Tăng thời gian ủ thành 4 độ C qua đêm, hoặc 3 -4 h ở nhiệt độ phòng – Thử sử dụng một chất hỗ trợ kháng thể (antibody enhancer) |
| Mất hoạt tính của kháng thể | – Sử dụng kháng thể được bảo quản cẩn thận – Kiểm tra hạn sử dụng của kháng thẻe – Tránh sử dụng nhiều lần kháng thể trước pha loãng. |
| Thời gian phơi sáng khi chụp quá ngắn | – Tăng thời gian phơi sáng – Sử dụng tính năng Smart Exposure nếu bạn có máy iBright FL1000 |
| Cài đặt trên thiết bị chưa đúng | – Đảm bảo rằng khoảng kích thuchs và phát xạ được lựa chọn đúng với chất phát huỳnh quang mong muốn |
| Sử dụng chất tẩy rửa | – Sử dụng quá nhiều chất tẩy rửa hoặc có bản chất tương đương có thể làm mất tín hiệu – hãy giảm hoặc bỏ chất tẩy rửa đi |
| Đệm khóa màng đã phủ cả kháng nguyên | – Một số đệm khóa màng có thể phủ kín màng và làm giảm đi lượng kháng nguyên thực tế có để kháng thể bát, nhất là nếu bước khóa màng lâu hơn 1h – Pha loãng kháng thể sơ cấp trong đệm giống với đệm rửa. – Hãy cân nhắc đệm khóa màng khác |
| Lượng mẫu đưa lên gel | – Quá nhiều dịch ly giải có thể lấn át đích đặc hiệu của bạn và giảm độ nhạy của kháng thể. – Quá ít dịch ly giải dẫn đến không đủ kháng nguyên quan tâm – Hãy thí nghiệm với một chuỗi pha loãng dịch ly giải hoặc mẫu để xác định lượng protein tối ưu cần cho lên gel. |
| Chuyển màng không tốt, hoặc mất protein sau khi chuyển màng | – Kiểm tra điều kiện chuyển để xác nhận bước chuyển màng – Có thể cần tối ưu lại bước này khi bạn muốn phát hiện protein khác. |
Vấn đề tín hiệu nền (cao, không ổn định hoặc hạt)
| Nguyên nhân | Giải pháp |
| Nền cao do màng bị bẩn | – Sử dụng kẹp để thao tác với màng và khay ủ phải sạch – Xác định đệm khóa màng phù hợp nhất cho thí nghiệm – các kháng thể sơ cấp có thể phản ứng khác nhau trong các đệm khóa màng khác nhau. Các đệm khóa màng như huyết thanh động vật hoặc sữa có thể gây ra hoạt tính chéo – Hạn chế sử dụng chất tẩy rửa trong bước khóa màng, vì các chất tẩy rửa thông thường có thể tự phát quang và thực tế sẽ tăng tín hiệu nền không đặc hiệu. Sau khi khóa, các chất tẩy rửa có thể sử dụng được. |
| Quá nhiều thang chuẩn protein | – Giảm lượng thang chuẩn khối lượng lên gel |
| Việc rửa hoặc dung dịch pha loãng không tối ưu | – Sử dụng đệm rửa với 0.1–0.2% Tween 20 – Chuẩn bị kháng thể sơ cấp pha loãng trong 0.05% Tween 20 – Tăng số lượng hoặc thời lượng rửa |
| Nhiễu nền cao do quá nhiều kháng thể thứ cấp | – Tối ưu độ pha loãng của kháng thể thứ cấp phụ thuộc vào thuốc nhuộm huỳnh quang, |
| Nhiễu nền không đồng đều do màng bị khô | – Đảm bảo toàn bộ bề mặt blot tong tất cả các bước ủ – Đảm bảo khuấy ổn định trong mỗi bước ủ |
| Chọn màng chưa chuẩn | Bản chất của màng có thẻ ảnh hưởng đến tín hiệu nền; ví dụ, màng PVDF có thể tự phát huỳnh quang và gây tín hiệu nền cao, vì thế hãy dùng màng PVDF phát huỳnh quang thấp |
| Hạt hoặc vân tay trên màng | – Dùng kẹp sạch để thao tác với màng và tránh chạm trực tiếp vào màng; các hạt hoặc chất nhiễm bẩn từ dụng cụ không sạch có thể phát quang – Sử dụng khay và đĩa sạch – ngâm với methanol rồi với nước sẽ giúp hòa tan các thuốc nhuộm còn sót lại từ lần trước. – Lạch sạch các thiết bị chuyển màng và vật tư tiêu hao bị bụi bặm nếu chuyển màng ướt, vì chúng có thể dính các hạt lên màng. – Làm sạch bề mặt chụp ảnh với cồn để loại bỏ bụi bặm, sợi vải và các thứ còn sót lại trước khi chụp ảnh. |
Tất cả ảnh trong bài viết được tham khảo từ thermofisher.com
iceberg (biên tập)
tapchisinhhoc.com
