Di truyền ngược là gì?
Di truyền ngược là một kỹ thuật di truyền phân tử thử nghiệm cho phép các nhà nghiên cứu làm sáng tỏ chức năng gen bằng cách kiểm tra những thay đổi về kiểu hình (của tế bào hoặc sinh vật) gây ra bởi các chuỗi axit nucleic cụ thể về mặt kỹ thuật di truyền (trong ADN hoặc ARN).
Di truyền ngược (reverse genetics) là quá trình ngược lại với di truyền thuận (forward genetics).
Trong di truyền thuận, nghiên cứu thông thường bắt đầu bằng kiểu hình đột biến, tiến hành chứng minh sự tồn tại của gen liên quan bằng cách phân tích tỷ lệ thế hệ con cháu, và cuối cùng nhân bản và giải trình tự gen để xác định trình tự ADN và protein của gen đó.
Các cơ sở di truyền chịu trách nhiệm cho một kiểu hình cụ thể được thiết lập – tức là bằng cách kiểm tra các đột biến xảy ra tự nhiên hoặc đột biến do bức xạ hoặc hóa chất gây ra. Các cá thể đột biến (tế bào hoặc sinh vật) được phân lập dựa trên kiểu hình của chúng và bộ gen của chúng được lập bản đồ để xác nhận kiểu hình với di truyền.
Tuy nhiên, di truyền ngược bắt đầu từ các đột biến ADN (cDNA) và giúp hiểu được chức năng của gen bằng cách phân tích các tác động kiểu hình gây ra bởi các chuỗi axit nucleic cụ thể về kỹ thuật di truyền.
Việc thay đổi trình tự di truyền trong di truyền ngược thường liên quan đến việc xóa có hướng và đột biến điểm (gây đột biến định hướng tại chỗ) để tạo ra các alen null (không có chức năng); chẳng hạn như loại bỏ gen.
Ở chuột, điều này có thể tạo ra một sinh vật có gen cụ thể bị ‘loại bỏ’ và sau đó có thể quan sát được kiểu hình của động vật. Loại bỏ dẫn đến các sinh vật di truyền (hoặc tế bào) mất chức năng vĩnh viễn ngay từ khi sinh ra.
Các kỹ thuật khác bao gồm kỹ thuật di truyền để thay thế các chuỗi ADN bằng sự thay thế một đối một – được gọi là đột nhập gen (gene knock-in) – sau đó được đưa vào một vị trí cụ thể.
CRISPR-Cas9 có thể đạt được cả loại trực tiếp và loại trực tiếp, cùng với các hình thức kỹ thuật di truyền cụ thể và nhắm mục tiêu cao khác – nhờ đó bộ gen của tế bào có thể được cắt tại một vị trí cụ thể cho phép loại bỏ gen hoặc trình tự được thiết kế mới để được chèn vào thay thế.
Việc loại bỏ gen (gene knockdowns) – một dạng loại bỏ gen không hoàn chỉnh – có thể đạt được bằng cách làm im lặng gen bằng cách sử dụng phương pháp can thiệp RNA (RNAi), điển hình là bởi siRNA hoặc Vivo-Morpholinos. Sự sụp đổ về mặt di truyền thường là tạm thời trong khi sự sụp đổ về mặt di truyền là vĩnh viễn.
RNAi đặc biệt hữu ích trong việc tiêu diệt một gen mà không thực sự phải thay đổi trình tự di truyền và có thể là một công cụ trị liệu hữu ích trong điều trị ung thư, bệnh thần kinh và nhiễm virus. RNAi cũng là một công cụ di truyền ngược hiệu quả trong việc tạo ra kiểu hình mất chức năng của gen ở bất kỳ giai đoạn nào.
Ngược lại, sự biểu hiện quá mức của gen bình thường được quan tâm cũng có thể được thao tác di truyền hoặc biểu hiện quá mức các dạng đột biến được biến đổi gen của gen.
Việc biểu hiện quá mức một alen đột biến (trong khi có một alen chức năng) có thể dẫn đến tương tác âm tính trội, theo đó alen đột biến tạo ra protein không có chức năng ‘vượt trội’ protein chức năng.
Ứng dụng của công nghệ di truyền ngược
Cho đến nay, di truyền ngược đã được ứng dụng trong việc tạo ra động vật (hoặc tế bào) biến đổi gen để nghiên cứu ảnh hưởng của các đột biến gen cụ thể (chèn, xóa, loại bỏ, loại bỏ) đối với kiểu hình.
Tuy nhiên, di truyền ngược có nhiều ứng dụng điều trị quan trọng – đặc biệt là trong việc chế tạo vắc-xin chống lại virus và/hoặc tái tạo bộ gen virus.
Di truyền ngược được xem là một công cụ cực kỳ hữu ích để nghiên cứu chức năng của từng gen virus.
Công nghệ di truyền ngược cho phép các nhà nghiên cứu thiết kế hợp lý các virus tái tổ hợp cải tiến để sử dụng trong các ứng dụng lâm sàng như tiêm chủng và liệu pháp tiêu diệt virus thử nghiệm. Đặc biệt, di truyền ngược đã cách mạng hóa việc nghiên cứu virus ARN.
Ngoài ra, nhiều loại virus oncolytic tái tổ hợp khác nhau đã được thiết kế thông qua di truyền ngược để cải thiện tính chọn lọc ung thư, độ an toàn, độc tính ung thư và kích thích khả năng miễn dịch đặc hiệu của khối u.
Di truyền ngược cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển các phiên bản vắc xin sống giảm độc lực có tính đặc hiệu cao chống lại các loại virus cụ thể.
Trong phát triển vắc xin, phương pháp di truyền ngược có thể được sử dụng để tạo ra các chủng virus có khả năng gây bệnh giảm nhưng vẫn được hệ thống miễn dịch nhận diện mạnh mẽ để tạo ra kháng thể chống lại virus. Làm như vậy cho phép thực hiện những thay đổi cụ thể đối với bộ gen của virus, tạo ra các loại vắc xin tiên tiến hơn (vắc xin sống giảm độc lực) so với vắc xin bất hoạt qua trung gian nhiệt truyền thống.
Vắc xin sống giảm độc lực có khả năng sinh miễn dịch cao hơn so với vắc xin bất hoạt do vi rút ‘sống’, tuy nhiên, điều này có thể gây ra vấn đề ở những người bị suy giảm miễn dịch (suy giảm miễn dịch).
Vắc xin sống giảm độc lực được tạo ra bằng cách sử dụng các công cụ di truyền ngược để kết hợp các gen từ virus hiện tại (mới) với các virus đã bị biến đổi (giảm độc lực) trước đó thuộc cùng một chủng. Tuy nhiên, vì những virus sống này bị suy yếu nên chúng không thể sao chép ở mức độ tương tự như những virus sống không bị suy yếu, do đó chúng không còn khả năng lây nhiễm đầy đủ vào vật chủ nhưng đủ để khả năng miễn dịch có thể phát triển.
Ví dụ thành công nhất về vắc-xin sống giảm độc lực là vắc-xin cúm, có thể bảo vệ tới 90% ở người lớn dưới 65 tuổi và tới 40% người lớn trên 65 tuổi.
Virus cúm A có 8 đoạn RNA. Trong vắc xin sống giảm độc lực, sự kết hợp của 6 phân đoạn giảm độc lực kết hợp với 2 phân đoạn bình thường (WT) – được biến đổi gen thành plasmid – tạo ra vắc xin sống giảm độc lực.
Liên quan đến hội chứng hô hấp cấp tính nặng do virus Corona 2 (SARS-CoV-2), loại vi rút gây ra COVID-19, nhiều nhóm độc lập đã sử dụng thành công phương pháp di truyền ngược để tái tạo lại bộ gen đầy đủ của virus và đánh giá các trình tự cụ thể giúp nó liên kết với thụ thể của nó (ACE2) cũng như các thành phần chính khác của virus.
Làm như vậy sẽ mang lại sự thúc đẩy lớn với hy vọng tạo ra vắc xin sống giảm độc lực cho SARS-CoV-2, tuy nhiên, chỉ có thời gian mới biết được liệu nó có hiệu quả trong việc ngăn ngừa COVID-19 hay không.
Tóm lại, di truyền ngược đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của các tế bào và sinh vật biến đổi gen cho phép các nhà khoa học hiểu được chức năng gen bằng cách quan sát những thay đổi về kiểu hình của chúng. Các ví dụ bao gồm “động vật bị loại” hoặc việc sử dụng CRISPR-Cas9.
Về mặt điều trị, di truyền ngược được sử dụng rộng rãi để biến đổi gen của bộ gen virus nhằm thay đổi khả năng gây bệnh của chúng trong quá trình phát triển vắc xin sống giảm độc lực, có khả năng sinh miễn dịch cao hơn so với vắc xin bất hoạt truyền thống.
Ứng dụng của di truyền ngược trong virus học ung thư
Phương pháp di truyền ngược tạo virus gây bệnh Newcastle (Nguồn: Bello, 2020)
Hầu như tất cả các họ virus đều có hệ thống di truyền ngược.
Đối với các virus ADN (adenovirus, HSV và virus vaccinia), di truyền ngược là một nhiệm vụ tương đối đơn giản vì hầu như tất cả các bộ gen ADN của virus (có khả năng lây nhiễm khi truyền máu) đều có thể bị đột biến trong ống nghiệm.
Đối với virus ARN, di truyền ngược là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất để nghiên cứu các đặc tính sinh học và đặc điểm phân tử của chúng.
Di truyền ngược của virus ARN liên quan đến việc thao tác bộ gen của chúng ở cấp độ cDNA, sau đó là các quy trình để tạo ra virus con cháu có khả năng lây nhiễm sống (loại hoang dã hoặc bị đột biến) sau khi chuyển cDNA vào tế bào.
Gần đây, công nghệ di truyền ngược dựa trên plasmid đã được áp dụng rộng rãi để tối ưu hóa tác dụng của virus RNA oncolytic, chẳng hạn như virus viêm miệng mụn nước (VSV), virus gây bệnh Newcastle (NDV) và virus sởi (MV).
Những virus oncolytic tái tổ hợp này có thể biểu hiện yếu tố tiêu diệt khối u ngoại sinh là cytokine hoặc chemokine để đạt được hiệu quả điều trị tốt trong các thử nghiệm lâm sàng.
Tài liệu tham khảo
- Griffiths et al, 2000. Reverse Genetics. An Introduction to Genetic Analysis 7th Edition. New York: W.H. Freeman.
- Nogales & Martinez-Sobrido, 2017. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 2017 Jan; 18(1): 20.
- Bello, M. B.; et al. Exploring the prospects of engineered Newcastle disease virus in modern vaccinology. Viruses. 2020, 12(4): 451.
){kind=link}