dPCR là gì? và vì sao PCR kỹ thuật số ngày càng được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử, xét nghiệm di truyền và phát triển sinh phẩm? dPCR chia mẫu thành hàng nghìn hoặc hàng chục nghìn phản ứng nhỏ, sau đó xác định từng phân vùng dương tính hoặc âm tính để ước tính số phân tử ADN hoặc ARN mục tiêu. Công nghệ này đặc biệt hữu ích khi cần định lượng chính xác, phát hiện biến thể hiếm hoặc phân tích số bản sao gen.
dPCR là gì?
dPCR là viết tắt của digital polymerase chain reaction, tiếng Việt thường gọi là PCR kỹ thuật số hoặc PCR số. Đây là một phương pháp định lượng axit nucleic dựa trên việc chia hỗn hợp PCR thành số lượng lớn các phản ứng có thể tích rất nhỏ, gọi là các phân vùng.
Sau khi PCR hoàn tất, mỗi phân vùng được phân loại dựa trên tín hiệu huỳnh quang. Phân vùng chứa trình tự mục tiêu thường cho tín hiệu dương tính, trong khi phân vùng không chứa mục tiêu được xác định là âm tính.
Tỷ lệ giữa các phân vùng dương tính và âm tính được đưa vào mô hình thống kê để ước tính số phân tử mục tiêu ban đầu.
Khái niệm digital PCR được Vogelstein và Kinzler sử dụng trong công trình công bố năm 1999. Các tác giả mô tả cách phân tách và khuếch đại những phân tử ADN riêng biệt để phát hiện đột biến hiếm trong một quần thể ADN lớn.
Vì sao gọi là PCR kỹ thuật số?
Trong qPCR, máy theo dõi sự gia tăng của tín hiệu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại và xác định giá trị Cq. Dữ liệu về cơ bản là tín hiệu liên tục.
Trong dPCR, kết quả cuối cùng của từng phân vùng được chuyển thành trạng thái phân loại. Phân vùng được coi là dương tính hoặc âm tính.
Chính cách biểu diễn dữ liệu gần với hệ nhị phân này tạo nên tên gọi digital PCR.
Điểm quan trọng là dPCR vẫn sử dụng phản ứng PCR, mồi, đầu dò huỳnh quang và enzyme tương tự nhiều phép thử qPCR. Khác biệt cốt lõi nằm ở việc phân vùng mẫu trước khi khuếch đại và phương pháp tính toán sau phản ứng.
*** Xem thêm: PCR thời gian thực – qPCR là gì?
dPCR và ddPCR có giống nhau không?
Hai thuật ngữ này thường bị sử dụng thay thế cho nhau, nhưng về mặt kỹ thuật chúng không hoàn toàn đồng nghĩa.
- dPCR là tên gọi chung của PCR kỹ thuật số.
- ddPCR là viết tắt của droplet digital PCR, tức một dạng dPCR trong đó hỗn hợp phản ứng được phân chia thành các giọt nước rất nhỏ nằm trong pha dầu. Mỗi giọt hoạt động như một phản ứng PCR riêng biệt.
Ngoài ddPCR còn có các hệ thống dPCR dùng chip, vi giếng và buồng vi lưu.
Hindson và cộng sự năm 2011 mô tả một hệ thống droplet digital PCR có khả năng tạo khoảng 20.000 giọt từ một hỗn hợp phản ứng 20 microlit. Nghiên cứu này góp phần quan trọng vào việc đưa ddPCR trở thành nền tảng có thể triển khai rộng rãi trong phòng thí nghiệm.
Nguyên lý dPCR hoạt động như thế nào?
Muốn hiểu đầy đủ dPCR là gì, cần nắm được ba thành phần cốt lõi của phương pháp, gồm phân vùng mẫu, khuếch đại PCR tại điểm cuối và tính toán dựa trên xác suất.
Phân vùng mẫu thành nhiều phản ứng độc lập
Một hỗn hợp PCR ban đầu được chia thành hàng nghìn hoặc hàng chục nghìn phân vùng có thể tích rất nhỏ. Phân tử ADN hoặc ARN mục tiêu được phân bố ngẫu nhiên giữa các phân vùng. Vì vậy, một phân vùng có thể không chứa phân tử mục tiêu, chứa một phân tử hoặc chứa nhiều phân tử.
Nếu lượng mẫu và số phân vùng phù hợp, phần lớn phân vùng sẽ chứa số lượng phân tử mục tiêu thấp. Đây là điều kiện giúp phương pháp chuyển một hỗn hợp phức tạp thành nhiều phép thử gần với mức phân tử đơn.
Hướng dẫn dMIQE 2020 mô tả phân vùng là nền tảng của phép đo dPCR. Sự phân bố ngẫu nhiên của phân tử đích cho phép sử dụng xác suất để suy ra nồng độ ban đầu.
PCR diễn ra trong từng phân vùng
Sau khi phân vùng, toàn bộ hệ thống được đưa qua chu trình nhiệt PCR.
Nếu phân vùng chứa trình tự mục tiêu và phản ứng khuếch đại thành công, tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Sau phản ứng, thiết bị đọc tín hiệu của từng phân vùng.
Các phân vùng có tín hiệu vượt tiêu chí phân loại được xác định là dương tính. Các phân vùng còn lại được xác định là âm tính.
Khác với qPCR, dPCR thông thường không sử dụng thời điểm tín hiệu vượt ngưỡng trong từng chu kỳ để định lượng. Việc đọc tín hiệu chủ yếu được thực hiện tại điểm cuối của phản ứng.
Vì sao dPCR cần thống kê Poisson?
Nếu có 10.000 phân vùng và 2.000 phân vùng dương tính, không thể kết luận mẫu ban đầu có chính xác 2.000 phân tử.
Nguyên nhân là một số phân vùng dương tính có thể chứa hai hoặc nhiều phân tử mục tiêu ngay từ đầu.
dPCR giải quyết vấn đề này bằng mô hình phân bố Poisson.
Nếu N là tổng số phân vùng hợp lệ và N0 là số phân vùng âm tính, số phân tử mục tiêu trung bình trong mỗi phân vùng có thể được biểu diễn:
λ = ln(N/N0)
Khi biết λ và thể tích của một phân vùng, phần mềm có thể ước tính nồng độ của trình tự mục tiêu.
Đây là điểm cần hiểu chính xác khi giải thích dPCR là gì. Máy không trực tiếp nhìn thấy và đếm từng phân tử ADN ban đầu. Hệ thống đếm trạng thái của các phân vùng, sau đó suy luận số phân tử bằng mô hình xác suất.
dPCR có thực sự là định lượng tuyệt đối không?
Thuật ngữ định lượng tuyệt đối thường được sử dụng vì dPCR có thể xác định nồng độ mục tiêu mà không cần dựng đường chuẩn ngoại sinh trong mỗi lần chạy giống nhiều quy trình qPCR.
Tuy nhiên, định lượng tuyệt đối không có nghĩa kết quả hoàn toàn không có sai số.
Kết quả vẫn phụ thuộc vào thể tích phân vùng, khả năng phân bố ngẫu nhiên của phân tử, hiệu suất tách chiết, tính toàn vẹn của ADN, thiết kế mồi, đầu dò, cách đặt ngưỡng và thuật toán xử lý.
NIST nhận định dPCR có giá trị lớn trong việc xác định nồng độ vật liệu tham chiếu axit nucleic, nhưng phương pháp vẫn cần tối ưu, đánh giá độ không đảm bảo và kiểm soát các nguồn sai số.
Các dạng dPCR phổ biến
Các hệ thống dPCR hiện nay khác nhau chủ yếu ở phương pháp tạo phân vùng.
Droplet digital PCR
Droplet digital PCR tạo ra số lượng lớn giọt nước trong dầu. Mỗi giọt chứa hỗn hợp PCR và hoạt động như một vi phản ứng riêng biệt.
Sau khuếch đại, từng giọt đi qua hệ thống đọc huỳnh quang hoặc được chụp ảnh để xác định trạng thái.
Ưu điểm của cách tiếp cận này là có thể tạo số lượng phân vùng lớn từ một thể tích phản ứng tương đối nhỏ.
Chip digital PCR
Chip digital PCR sử dụng chip có nhiều buồng phản ứng hoặc vi giếng. Mẫu được phân phối vào các vị trí đã định trước.
Do cấu trúc phân vùng cố định, thể tích và vị trí của từng phản ứng có thể được kiểm soát khá chặt chẽ.
Nanowell và hệ thống vi lưu
Một số nền tảng sử dụng mạng lưới vi giếng rất nhỏ hoặc hệ thống vi lưu để chia mẫu.
Sự khác biệt giữa các nền tảng không đơn thuần nằm ở số lượng phân vùng. Phòng xét nghiệm cần xem xét thể tích mẫu thực sự được phân tích, tỷ lệ phân vùng hợp lệ, số kênh huỳnh quang, khả năng multiplex, mức độ tự động hóa, công suất mẫu và chi phí vật tư.
Quy trình thực hiện dPCR trong phòng thí nghiệm
Quy trình dPCR có thể được hệ thống hóa như sau.
Chất lượng mẫu quyết định chất lượng phép đo
Một ưu điểm thường được nhắc đến của dPCR là khả năng chịu ảnh hưởng của một số chất ức chế tốt hơn qPCR trong những điều kiện nhất định. Điều đó không có nghĩa có thể bỏ qua chất lượng mẫu.
Sai số xảy ra trước PCR vẫn được đưa vào kết quả cuối cùng.
Nếu chỉ 60 phần trăm ADN ban đầu được thu hồi trong quá trình tách chiết, dPCR không thể tự suy ra 40 phần trăm đã bị mất.
Đây là lý do dMIQE 2020 nhấn mạnh việc mô tả đầy đủ phương pháp lấy mẫu, bảo quản, tách chiết và xử lý axit nucleic.
Thiết kế mồi và đầu dò
Mồi cần có độ đặc hiệu cao với locus mục tiêu. Với xét nghiệm biến thể điểm, vị trí của đầu dò và điều kiện lai có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân biệt alen.
Các trình tự tương đồng, pseudogene hoặc biến thể nằm tại vị trí gắn mồi có thể làm giảm hiệu suất.
Khi phát triển một assay dPCR mới, tối ưu nhiệt độ gắn mồi thường là một bước quan trọng để tăng khoảng cách giữa các cụm tín hiệu.
*** Xem thêm: Oligonucleotide là gì? Cấu trúc và ứng dụng trong sinh học phân tử
Có cần cắt ADN trước dPCR không?
Trong một số ứng dụng, ADN hệ gen có kích thước lớn hoặc plasmid có cấu trúc vòng có thể ảnh hưởng khả năng phân vùng và khuếch đại.
Xử lý bằng enzyme giới hạn có thể giúp giảm độ nhớt, tuyến tính hóa plasmid hoặc tách các locus đang liên kết vật lý.
Tuy nhiên, enzyme phải được lựa chọn để không cắt vào trình tự mục tiêu. Nếu mẫu đã bị phân mảnh mạnh, việc xử lý thêm có thể làm mất các khuôn có khả năng khuếch đại.
NIST cũng cho thấy phương pháp tách chiết có thể ảnh hưởng trạng thái mạch của ADN và từ đó tác động đến kết quả định lượng dPCR.
Cách đọc kết quả dPCR
Một phần quan trọng để hiểu dPCR là gì nằm ở khả năng đọc biểu đồ và đánh giá chất lượng dữ liệu.
Phân vùng dương tính và âm tính
Trong biểu đồ một chiều, mỗi điểm thường đại diện cho một phân vùng.
- Nhóm điểm có tín hiệu huỳnh quang thấp thường là các phân vùng âm tính.
- Nhóm điểm có tín hiệu cao hơn là các phân vùng dương tính.
Nếu hai cụm được tách rõ, việc phân loại tương đối thuận lợi. Khi các cụm chồng lấn, độ không chắc chắn tăng lên.
Threshold là gì?
Threshold là ngưỡng được sử dụng để phân biệt phân vùng dương tính và âm tính.
Đặt threshold quá thấp có thể làm tăng số phân vùng được xác định nhầm là dương tính. Đặt quá cao có thể bỏ sót các tín hiệu thật có biên độ thấp.
Các phương pháp đặt ngưỡng thủ công cần được sử dụng thận trọng. Tổng quan của De Spiegelaere và cộng sự về phân loại phân vùng cho thấy phân loại sai có thể là nguồn quan trọng tạo thiên lệch định lượng, đặc biệt khi lượng mục tiêu rất thấp hoặc có nhiều tín hiệu trung gian.
Rain trong dPCR là gì?
Rain là thuật ngữ thường dùng để mô tả những phân vùng có tín hiệu nằm giữa cụm âm tính và dương tính.
Rain có thể xuất hiện do khuếch đại không hoàn toàn, ADN bị tổn thương, chất ức chế, trình tự không khớp hoàn toàn với đầu dò hoặc điều kiện nhiệt chưa tối ưu.
Không nên mặc định toàn bộ rain là dương tính hoặc âm tính.
Cần đánh giá đồng thời mẫu trắng, mẫu âm tính, mẫu dương tính, thiết kế assay và hình dạng phân bố tín hiệu.
Copies per microliter có nghĩa gì?
Kết quả dPCR thường được biểu diễn dưới dạng số bản sao trên microlit.
Tuy nhiên, phải xác định con số đó đang phản ánh nồng độ trong hỗn hợp PCR, dịch chiết axit nucleic hay mẫu sinh học ban đầu.
Muốn quy đổi về mẫu gốc cần tính thể tích tách chiết, thể tích pha loãng, lượng mẫu đầu vào và hệ số pha loãng.
Nếu bỏ qua các bước quy đổi này, kết quả có thể đúng về mặt thiết bị nhưng sai về mặt diễn giải mẫu.
So sánh dPCR và qPCR
dPCR và qPCR đều là công nghệ PCR định lượng, nhưng phù hợp với các mục tiêu khác nhau.
- dPCR thường có lợi thế khi cần phân giải khác biệt nhỏ về nồng độ hoặc phát hiện một alen hiếm trong nền ADN lớn.
- qPCR vẫn có ưu thế rõ ràng với xét nghiệm thường quy số lượng lớn, mục tiêu quen thuộc và yêu cầu trả kết quả nhanh với chi phí thấp.
Tổng quan của Gleerup và cộng sự năm 2025 về ứng dụng dPCR trong virus học cũng lưu ý chi phí và thông lượng vẫn là những yếu tố hạn chế việc thay thế qPCR trong các chương trình xét nghiệm quy mô lớn.
So sánh dPCR và NGS
dPCR và giải trình tự thế hệ mới, Next Generation Sequencing, NGS, giải quyết hai nhóm câu hỏi khác nhau.
- dPCR rất mạnh khi đã biết mình cần tìm gì.
- NGS mạnh khi cần khảo sát nhiều trình tự cùng lúc hoặc chưa biết chính xác biến thể cần tìm.
Một chiến lược có giá trị trong nghiên cứu và y học chính xác là sử dụng NGS để phát hiện biến thể, sau đó phát triển assay dPCR đặc hiệu để xác nhận hoặc theo dõi biến thể mục tiêu trong các mẫu tiếp theo.
*** Xem thêm: Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới NGS là gì?
Ứng dụng của dPCR
Tổng quan của Wainman, Sathyanarayana và Lefferts năm 2024 cho thấy dPCR hiện được nghiên cứu và triển khai trong ung thư, vi sinh, bệnh truyền nhiễm, di truyền học, sàng lọc trước sinh và nhiều lĩnh vực xét nghiệm phân tử khác.
Phát hiện biến thể hiếm
Đây là một trong những ứng dụng nổi bật nhất của dPCR.
Giả sử một mẫu chứa lượng lớn alen bình thường và một tỷ lệ rất nhỏ alen đột biến. Khi toàn bộ ADN được khuếch đại trong cùng một phản ứng, tín hiệu của alen hiếm có thể bị nền lớn che lấp.
Phân vùng giúp tách các phân tử vào những phản ứng riêng biệt. Một số phân vùng vì thế có thể chứa alen đột biến nhưng ít hoặc không chứa alen bình thường.
Khả năng này tạo điều kiện phát hiện các biến thể có tỷ lệ thấp khi assay được thiết kế và xác nhận thích hợp.
Sinh thiết lỏng và ctDNA
ADN khối u lưu hành, circulating tumor DNA, thường chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong tổng ADN tự do lưu hành.
Nếu đã biết biến thể đặc hiệu của khối u, dPCR có thể được sử dụng để nghiên cứu sự hiện diện hoặc thay đổi tỷ lệ của biến thể đó trong huyết tương.
Đây là một trong những hướng ứng dụng được quan tâm trong theo dõi ung thư, đáp ứng điều trị và bệnh tồn dư.
Tuy nhiên, độ nhạy phân tích cao không tự động đồng nghĩa với giá trị chẩn đoán lâm sàng. Mỗi assay cần được xác nhận riêng về giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu và ý nghĩa lâm sàng.
*** Xem thêm: Sinh thiết lỏng là gì?
Phân tích số bản sao gen
Copy number variation là thay đổi số lượng bản sao của một vùng ADN.
dPCR có thể định lượng locus mục tiêu và so sánh với locus tham chiếu để ước tính số bản sao.
Ứng dụng này có giá trị trong nghiên cứu di truyền, phát triển dòng tế bào, kiểm tra vector và đặc trưng vật liệu tham chiếu.
NIST hiện sử dụng và nghiên cứu dPCR trong định lượng các vật liệu tham chiếu ADN và ARN phục vụ chuẩn hóa phép đo sinh học phân tử.
Định lượng ARN và biểu hiện gen
ARN cần được phiên mã ngược thành ADN bổ sung trước hoặc trong quy trình dPCR.
RT dPCR có thể được sử dụng để định lượng mARN, microRNA và ARN virus.
Tuy nhiên, phản ứng phiên mã ngược tạo thêm một nguồn biến thiên. Hiệu suất chuyển đổi ARN thành ADN bổ sung cần được xem xét khi diễn giải kết quả.
Phát hiện và định lượng tác nhân vi sinh
dPCR được nghiên cứu rộng rãi trong định lượng virus, vi khuẩn và các gen liên quan đến kháng thuốc.
Một lợi thế tiềm năng là khả năng phát hiện lượng mục tiêu thấp và độ ổn định cao hơn trong một số nền mẫu chứa chất ức chế.
Tuy nhiên, đối với xét nghiệm quy mô lớn, qPCR vẫn có lợi thế về công suất và chi phí.
Sàng lọc và chẩn đoán di truyền trước sinh
dPCR đã được nghiên cứu để phát hiện bất thường số lượng nhiễm sắc thể và các biến thể di truyền xác định trước trong ADN tự do từ huyết tương mẹ.
Cần phân biệt rõ giữa nghiên cứu ứng dụng dPCR và các xét nghiệm sàng lọc hoặc chẩn đoán đã được xác nhận lâm sàng.
dPCR không phải công nghệ thay thế toàn diện NIPT dựa trên NGS và không thay thế các phương pháp chẩn đoán trước sinh khi có chỉ định.
Công nghệ gen và liệu pháp tế bào
Trong phát triển liệu pháp gen, dPCR có thể được sử dụng để định lượng vector, gen chuyển và số bản sao trình tự mục tiêu.
Công nghệ này cũng có giá trị trong kiểm soát chất lượng các quy trình sản xuất sinh học khi cần định lượng chính xác một trình tự xác định.
Sinh học môi trường và thực phẩm
dPCR được ứng dụng trong định lượng ADN môi trường, vi sinh vật, trình tự chuyển gen và một số mục tiêu trong kiểm nghiệm thực phẩm.
Với những mẫu có nồng độ rất thấp, sai số lấy mẫu và tách chiết có thể trở thành giới hạn lớn hơn bản thân phép đo PCR.
Ưu điểm của dPCR
Khi được thiết kế phù hợp, dPCR có khả năng định lượng mục tiêu mà không cần đường chuẩn ngoại sinh, phân giải thay đổi nhỏ về số bản sao và phát hiện một số biến thể hiếm đã biết.
Việc phân vùng cũng giảm cạnh tranh trực tiếp giữa các phân tử nằm ở những phân vùng khác nhau.
Độ chính xác thống kê có thể cao khi số phân vùng đủ lớn và tỷ lệ phân vùng dương tính nằm trong vùng đo thích hợp.
Đây là lý do dPCR ngày càng được sử dụng trong nghiên cứu vật liệu tham chiếu, sinh thiết lỏng, công nghệ gen và các phép thử yêu cầu định lượng chính xác.
Hạn chế của dPCR
dPCR không phải phương pháp tốt nhất cho mọi bài toán sinh học phân tử.
Nếu nồng độ mục tiêu quá cao, phần lớn phân vùng sẽ dương tính và hệ thống tiến gần trạng thái bão hòa. Khi đó, độ không đảm bảo của phép tính tăng và mẫu có thể phải pha loãng.
Ngược lại, nếu lượng mục tiêu quá thấp, chỉ một vài phân vùng dương tính xuất hiện. Kết quả trở nên rất nhạy với nhiễm chéo, dương tính giả và sai số lấy mẫu.
Khả năng multiplex của nhiều hệ thống dPCR vẫn thấp hơn đáng kể so với NGS.
Chi phí thiết bị và vật tư cũng có thể cao hơn qPCR, đặc biệt khi phòng xét nghiệm cần xử lý số lượng lớn mẫu nhưng chỉ thực hiện các xét nghiệm thông thường.
Một hạn chế quan trọng khác là dPCR thường cần biết trước trình tự mục tiêu. Nếu câu hỏi nghiên cứu là tìm kiếm hàng trăm hoặc hàng nghìn biến thể chưa biết, NGS phù hợp hơn.
Kiểm soát chất lượng và xác nhận phương pháp dPCR
Hiểu dPCR là gì ở mức chuyên sâu cần đi thêm một bước, đó là hiểu một kết quả dPCR tốt phải được xác nhận như thế nào.
Giới hạn mẫu trắng
Giới hạn mẫu trắng phản ánh lượng tín hiệu có thể xuất hiện trong các mẫu không chứa mục tiêu.
Thông số này đặc biệt quan trọng khi tìm biến thể hiếm.
Nếu các mẫu âm tính vẫn thường xuyên xuất hiện một hoặc hai phân vùng được phân loại dương tính, không thể coi mọi phân vùng dương tính đơn lẻ trong mẫu bệnh phẩm là bằng chứng chắc chắn của mục tiêu.
Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện là mức mục tiêu thấp mà phép thử có thể phát hiện với xác suất đã xác định.
Không nên xác định giới hạn phát hiện chỉ bằng cách tìm mẫu loãng nhất từng cho tín hiệu dương tính.
Cần thực hiện nhiều lần lặp ở các nồng độ thấp và đánh giá xác suất phát hiện.
Giới hạn định lượng
Một assay có thể phát hiện được mục tiêu nhưng chưa chắc định lượng chính xác ở cùng mức nồng độ đó.
Giới hạn định lượng vì vậy cần được xác định dựa trên tiêu chí độ đúng và độ chụm đã đặt trước.
Độ đúng, độ chụm và phạm vi đo
Phòng xét nghiệm cần đánh giá kết quả trên nhiều mức nồng độ và nhiều lần chạy.
Các biến số như người thao tác, lô hóa chất, ngày thực hiện và thiết bị có thể được đưa vào nghiên cứu độ tái lập nếu assay dự kiến sử dụng thường quy.
ISO 20395:2019 đưa ra các yêu cầu chung cho đánh giá hiệu năng và bảo đảm chất lượng của phương pháp định lượng trình tự axit nucleic bằng qPCR và dPCR.
Tính đến tháng 9 năm 2026, ISO 20395:2019 vẫn là International Standard hiện hành. ISO đang phát triển Edition 2 với mã ISO CD 20395.2, nhưng tài liệu này hiện mới ở giai đoạn Committee Draft và chưa thay thế tiêu chuẩn năm 2019.
dMIQE 2020 và khả năng tái lập kết quả
Huggett và nhóm dMIQE năm 2020 đề xuất bộ thông tin tối thiểu cần báo cáo trong nghiên cứu dPCR.
Các yếu tố quan trọng gồm nguồn mẫu, phương pháp tách chiết, trình tự mồi và đầu dò, thành phần phản ứng, điều kiện chu trình nhiệt, phương pháp phân vùng, số phân vùng, cách đặt threshold, đối chứng và phương pháp xử lý dữ liệu.
Mục tiêu của dMIQE không đơn thuần là chuẩn hóa cách viết bài báo. Hướng dẫn giúp người đọc có đủ thông tin để đánh giá độ tin cậy và tái lập phép thử.
Khi nào nên lựa chọn dPCR?
Ở góc độ thực hành phòng lab, dPCR phát huy giá trị rõ nhất khi câu hỏi phân tích được xác định trước.
- Nếu cần phát hiện một biến thể đã biết với tỷ lệ rất thấp, dPCR là phương án đáng cân nhắc.
- Nếu cần định lượng chính xác số bản sao của một locus, dPCR cũng có nhiều lợi thế.
- Nếu cần xét nghiệm một mục tiêu thông thường trên hàng trăm hoặc hàng nghìn mẫu, qPCR có thể kinh tế và thuận tiện hơn.
- Nếu cần khảo sát hàng trăm gen hoặc tìm các biến thể chưa biết, NGS thường là lựa chọn hợp lý hơn.
Như vậy, câu hỏi quan trọng đối với phòng xét nghiệm không phải dPCR có tốt hơn qPCR hay NGS hay không. Câu hỏi đúng là loại dữ liệu nào cần thu được và công nghệ nào tạo ra dữ liệu đó với độ tin cậy, công suất và chi phí phù hợp nhất.
Lưu ý y khoa
dPCR có độ nhạy phân tích cao nhưng không nên đồng nhất độ nhạy phân tích với khả năng chẩn đoán bệnh.
Một assay có thể phát hiện được vài phân tử mục tiêu nhưng vẫn tạo kết quả không chính xác về mặt lâm sàng nếu chưa xác định giới hạn mẫu trắng, giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu và giá trị dự báo trong quần thể sử dụng.
Các ứng dụng dPCR trong ung thư, bệnh truyền nhiễm, di truyền y học và chẩn đoán trước sinh cần được thực hiện bằng quy trình đã xác nhận và được diễn giải trong bối cảnh lâm sàng phù hợp.
Kết quả xét nghiệm liên quan đến bệnh lý hoặc nguy cơ di truyền cần được trao đổi với bác sĩ chuyên khoa hoặc chuyên gia tư vấn di truyền khi cần thiết.
FAQ – Câu hỏi thường gặp về dPCR
dPCR là gì?
dPCR là PCR kỹ thuật số, phương pháp chia hỗn hợp PCR thành số lượng lớn phân vùng nhỏ. Sau PCR, từng phân vùng được phân loại dương tính hoặc âm tính và dữ liệu được xử lý bằng thống kê Poisson để ước tính số phân tử ADN hoặc ARN mục tiêu.
dPCR và ddPCR khác nhau như thế nào?
dPCR là thuật ngữ chung cho PCR kỹ thuật số. ddPCR là một dạng dPCR sử dụng các giọt nước trong dầu để tạo phân vùng. Các nền tảng dPCR khác có thể sử dụng chip, vi giếng hoặc hệ thống vi lưu.
dPCR có cần đường chuẩn không?
Phép tính nồng độ cơ bản của dPCR không cần đường chuẩn ngoại sinh như phương pháp qPCR định lượng tuyệt đối truyền thống. Tuy nhiên, assay vẫn cần đối chứng, vật liệu tham chiếu phù hợp và nghiên cứu xác nhận để đánh giá độ đúng cũng như độ không đảm bảo đo.
dPCR có nhạy hơn qPCR không?
Trong một số bài toán như phát hiện biến thể hiếm hoặc mục tiêu có nồng độ thấp, dPCR có thể có lợi thế về độ nhạy và độ chụm. Không thể kết luận dPCR luôn tốt hơn qPCR vì hiệu năng phụ thuộc assay, nền mẫu, công suất và mục đích sử dụng.
dPCR có thay thế NGS được không?
Không. dPCR chủ yếu phù hợp với số lượng nhỏ các mục tiêu đã biết. NGS phù hợp hơn khi cần khảo sát nhiều gen, nhiều vùng hệ gen hoặc phát hiện biến thể chưa biết trước.
