Giải trình tự phân tử đơn là gì?

Giải trình tự phân tử đơn là gì?

Công nghệ giải trình tự phân tử đơn thực sự của Helicos Biosciences đã giới thiệu một phương pháp nghiên cứu bộ gen độc đáo thông qua phương pháp tiếp cận trực tiếp để giải trình tự ADN mục tiêu; một khả năng đã khắc phục được một trong những hạn chế đáng kể nhất của nhiều công nghệ giải trình tự ADN hàng đầu vào thời điểm đó.

Thay vì phân mảnh chuỗi ADN mục tiêu thành hàng nghìn mảnh nhỏ và tạo ra hàng triệu bản sao thông qua khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR), một phương pháp rất dễ gây ra lỗi và sai lệch, giải trình tự phân tử đơn lẻ hoàn toàn bỏ qua bước khuếch đại.

Ngoài ra, công nghệ giải trình tự phân tử đơn thực sự của Helicos quản lý để duy trì tính chất song song lớn và thông lượng cao của các công nghệ giải trình tự khác. Nhờ những thành tựu này, công nghệ của Helicos đã trở thành công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba đầu tiên tiếp cận thị trường thương mại vào năm 2009.

Chuẩn bị thư viện giải trình tự phân tử đơn

Để chuẩn bị ADN mục tiêu cho việc giải trình tự, trước tiên phân tử ADN sợi đôi được biến tính thành ADN chuỗi đơn (ssDNA) và chia thành các đoạn dài khoảng 100-200 nucleotide.

Sau đó, trình tự tiếp hợp poly-adenosine (polyA) chứa nucleotide adenosine huỳnh quang được thêm vào đầu 3′ của mỗi trình tự (Hình 1A).

Thư viện ADN thu được sau đó được lai vào tế bào dòng chảy của Helicos chứa hàng triệu trình tự oligonucleotide bổ sung cho bộ chuyển đổi polyA, để cố định thư viện ADN trên bề mặt tế bào dòng chảy (Hình 1B).

Sau đó, toàn bộ tế bào dòng chảy được kích thích bằng tia laser và máy ảnh sẽ vạch ra vị trí của từng đoạn ADN lai trên tế bào dòng chảy dựa trên sự chiếu sáng và phát hiện của bộ chuyển đổi polyA có nhãn huỳnh quang.

Tiếp theo, nhãn huỳnh quang của bộ chuyển đổi được tách ra và rửa sạch, do đó chuẩn bị sẵn sàng cho các đoạn ADN để giải trình tự (Hình 1C).

Hình 1: Quy trình chuẩn bị thư viện ADN giải trình tự phân tử đơn thực sự của Helicos.
A. Phân mảnh và biến tính phân tử ADN mục tiêu đang được giải trình tự và bổ sung bộ chuyển đổi polyA có nhãn huỳnh quang.
B. Bổ sung thư viện ADN vào tế bào dòng chứa các oligonucleotide bổ sung cho bộ chuyển đổi polyA và hình ảnh.
C. Tách nhãn huỳnh quang và rửa sạch.

Quy trình giải trình tự phân tử đơn

Trình tự bắt đầu khi DNA polymerase (DNAP) và một trong bốn chất kết thúc thuận nghịch deoxynucleotide triphosphate (rt-dNTPs), được thêm vào tế bào dòng chảy.

Kết quả là, nếu dNTP được thêm vào lại là nucleotide tiếp theo, thì DNAP sẽ thêm nó vào chuỗi ADN kéo dài (Hình 2A).

Sau đó, bất kỳ dNTP không liên kết nào sẽ bị cuốn trôi, các thẻ huỳnh quang được kích thích bằng tia laser và hình ảnh được chụp để xác định đoạn ADN nào trên tế bào dòng chảy gần đây đã được thêm DNTP vào chuỗi kéo dài (Hình 2B).

Điều quan trọng cần lưu ý là việc sử dụng rt-dNTP là cần thiết cho quá trình giải trình tự vì chúng cho phép DNAP chỉ thêm một nucleotide vào chuỗi kéo dài tại một thời điểm.

Điều này là do thẻ huỳnh quang phải được loại bỏ trước khi DNAP thêm một rt-dNTP khác.

Do đó, sau khi chụp ảnh và lưu trữ dữ liệu, thẻ huỳnh quang của dNTP tích hợp sẽ bị tách ra và quá trình lặp lại cho đến khi toàn bộ đoạn ADN được giải trình tự đầy đủ (Hình 2C).

Sau đó, tất cả dữ liệu được tạo ra sẽ được phân tích bằng phần mềm máy tính để xác định trình tự của phân tử ADN ban đầu.

Hình 2: Công nghệ giải trình tự phân tử đơn thực sự của Helicos.
A. Một trong bốn rt-dNTP được thêm vào tế bào dòng và DNAP thêm nó vào sợi kéo dài.
B. Rửa sạch các rt-dNTP không liên kết và hình ảnh của tế bào dòng để xác định sợi nào gần đây đã được tích hợp dNTP.
C. Loại bỏ thẻ huỳnh quang và lặp lại quy trình.

Ưu nhược điểm của giải trình tự phân tử đơn

Điểm mạnh lớn nhất của công nghệ giải trình tự phân tử đơn thực sự của Helicos là thực tế đây là công nghệ giải trình tự ADN đầu tiên giới thiệu trình tự phân tử đơn, đơn giản hóa đáng kể quy trình bằng cách loại bỏ khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

Điều này không chỉ đẩy nhanh quá trình chuẩn bị mẫu mà còn tránh được sai lệch và khả năng xảy ra lỗi tích lũy theo cấp số nhân có thể xuất hiện trong kết quả giải trình tự ADN.

Helicos, là công ty đầu tiên giới thiệu khả năng này, đã cho phép công nghệ của họ được áp dụng cho nhiều ứng dụng bao gồm phát hiện biến thể, nghiên cứu phiên mã, phát hiện thuốc cũng như thu thập và giải trình tự trực tiếp các axit nucleic.

Tuy nhiên, có những thách thức đáng chú ý liên quan đến việc sử dụng công nghệ này, bao gồm thực tế là bản thân quá trình giải trình tự mất nhiều thời gian hơn so với các công nghệ giải trình tự khác, do quá trình của Helicos bị tạm dừng sau mỗi bước mở rộng.

Ngoài ra, độ chính xác của nền tảng giải trình tự phân tử đơn đích thực không thể sánh được với các công nghệ cạnh tranh, đưa ra xếp hạng dưới mức trung bình chỉ ~ 99%.

Mặc dù là công nghệ giải trình tự ADN đơn phân tử và thế hệ thứ ba đầu tiên tiếp cận thị trường thương mại nhưng những nhược điểm của công nghệ Helicos khiến nó trở nên lỗi thời so với các đối thủ cạnh tranh.

Ngoài ra, các công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba mới có khả năng phân tử đơn đã bắt đầu xuất hiện hàng loạt và do đó làm giảm giá trị tính mới của công nghệ giải trình tự phân tử đơn thực sự của Helicos.

Do những rắc rối này, Helicos Biosciences đã nộp đơn xin phá sản vào năm 2012 . Nhìn chung, bất chấp sự sụp đổ của Helicos Biosciences, hoàn cảnh khó khăn của công ty đã giúp truyền cảm hứng cho Direct Genomics và việc họ tạo ra nền tảng giải trình tự thế hệ thứ ba sắp ra mắt có tên GenoCare.

Giống như những tổ chức tiền nhiệm, Direct Genomics đặt mục tiêu sử dụng nền tảng của họ cho các hoạt động giải trình tự ADN và đang tìm cách khởi động những nỗ lực này ở Châu Á – một trong những điểm nóng nghiên cứu thế hệ tiếp theo đang phát triển nhanh nhất trên thế giới.

Tài liệu tham khảo

• Thompson J, Steinmann K. Single Molecule Sequencing with a HeliScope Genetic Analysis System. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2010;92(1).
• Milos P. Helicos single molecule sequencing: unique capabilities and importance for molecular diagnostics. Genome Biol. 2010;11(Suppl 1):I14.
• Aird D, Ross M, Chen W, Danielsson M, Fennell T, Russ C, Jaffe D, Nusbaum C, Gnirke A. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 2011;12(2):R18.