Nội dung
Real-time PCR là gì? Những kiến thức cơ bản về Real-time PCR
Giới thiệu về Real-time PCR
Như cái tên đã gợi lên, real-time PCR (Realtime PCR, RT-PCR) là một kỹ thuật được dùng để kiểm soát diễn biến của một phản ứng PCR theo thời gian thực. Cùng một lúc, một lượng sản phẩm PCR (ADN, cDNA, ARN) tương đối nhỏ có thể được định lượng.
Real-time PCR dựa trên sự phát hiện huỳnh quang tạo ra bởi một phân tử báo cáo. Điều này diễn ra do sự tích tụ sản phẩm PCR theo từng chu kỳ khuếch đại. Các chất huỳnh quang báo cáo này có thể là các dye bám vào mạch đôi ADN (như SYBR® Green) hoặc đầu dò đặc hiệu (như Molecular Beacons or TaqMan® Probes).
Với RT-PCR, bạn có thể bắt đầu với lượng axit nucleic tổi thiểu và định lượng sản phẩm cuối cùng một cách chính xác; hơn nữa, không cần điện di sau khi định lượng, điều này giúp tiết kiệm thời gian và hóa chất. Những ưu điểm của kỹ thuật PCR định lượng dựa vào huỳnh quang đã cách mạng hóa hoàn toàn việc định lượng ADN và ARN.
Tuy nhiên, real-time PCR dĩ nhiên vẫn có thể dùng cho phân tích đính tính; việc sử dụng kỹ thuật nào phù hợp với mục đích của bạn phụ thuộc vào hiểu biết của bạn. PCR định lượng giờ đây có thể thực hiện dễ dàng, độ nhạy cao, độ đặc hiệu tăng và cho phép hướng đến sự tự động hóa.
Các máy dùng để thực hiện RT-PCR trước hết phải là một máy luân nhiệt (thermocycler) như các máy PCR thông thường để cho phép phản ứng khuếch đại diễn ra.
Ngoài ra, máy còn có một nguồn sáng kích thích để chiếu vào hỗn hợp phản ứng đồng thời đi kèm một bộ phận phát hiện tín hiệu huỳnh quang (detector) do các dye phát ra từ ống phản ứng.
Vì ánh sáng kích thước thường chiếu vào ống phản ứng PCR từ nắp xuống, nên chúng ta sẽ không được viết thông tin gì lên nắp ống nghiệm vì điều đó có thể ảnh hưởng tới sự truyền ánh sáng qua.
Sơ đồ cấu tạo đơn giản của máy real time PCR
Realtime PCR đã được dùng cho một số lượng lớn ứng dụng trong những năm qua nhưng những ứng dụng phổ biến nhất bao gồm: phân tích biểu hiện gen (mRNA), phân tích miRNA và RNA không dịch mã, phát hiện biến dị di truyền và đột biến điểm, phân tích SNP, phân biệt alen.
Dựa vào phân tử được dùng để định lượng, các kỹ thuật real-time PCR có thể được chia thành hai nhóm chính:
- Phát hiện không đặc hiệu sử dụng các dye bám ADN
- Đầu dò đặc hiệu phát hiện đích đặc hiệu
1. Phát hiện không đặc hiệu sử dụng các dye bám ADN
SYBR® Green là dye báo cáo bám mạch đôi ADN được sử dụng phổ biến nhất. SYBR® Green bám vào rãnh nhỏ (minor groove) của chuỗi xoắn kép DNA.
Trong dung dịch, các dye không bám sẽ phát tín hiệu rất thấp. Tín hiệu huỳnh quan được tăng cường đáng kể khi dye bám vào mạch đôi ADN. SYBR® Green vẫn bền vững dưới điều kiện PCR và đầu lọc quang của máy realtime có thể được thêm vào để làm hài hòa các bước sóng hấp thụ và phát xạ.
Ethidium bromide cũng có thể được dùng để phát hiện sự có mặt của mạch đôi nhưng do bản chất gây ung thư nên bị hạn chế sử dụng.
Nguyên lý định lượng của SYBR Green
Tiến trình của một chu kỳ định lượng Real-time PCR
– Khi dye SYBR được thêm vào mẫu, nó lập tức bám tất cả các ADN mạch đôi có mặt trong mẫu, khi đó nó phát tín hiệu.
– Trong PCR, DNA polymerase khuếch đại trình tự đích, tạo ra sản phẩm PCR.
– Dye SYBR bám vào mỗi bản sao mạch đôi mới
– Khi các chu kỳ tiếp diễn, nhiều sản phẩm PCR được tạo ra. Cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR
* Ưu điểm: được dùng để theo dõi sự khuếch đại bất cứ phân tử mạch đôi ADN nào ; không cần đầu dò, nên giảm quy trình chuẩn bị cũng như giá thành
* Nhược điểm: Có thể sinh ra dương tính giả bởi dye SYBR bám vào bất kỳ ADN mạch đôi nào, nó có thể bám vào các trình tự mạch đôi không đặc hiệu. Vì vậy cần có mồi thật tốt, và cần phân tích melt curve.
Đường cong nóng chảy (melt curve) thường được dựng ở cuối phản ứng định lượng, sau khi các chu kỳ khuếch đại đã hoàn tất.
Ở cuối chương trình Realtime PCR, máy PCR sẽ bắt đầu ở một nhiệt độ cài đặt trước (thường là cao hơn Tm của mồi) và đo mức độ phát huỳnh quang. Nhiệt độ của ống phản ứng sau đó được tăng lên rất từ từ trong khi máy vẫn tiếp tục đo cường độ phát quang.
Khi nhiệt độ tăng lên, ADN mạch đôi biến tính thành mạch đơn nhiều hơn, và dye SYBR Green bị rời ra, làm giảm cường độ phát quan.
Tại sao metl curve cho biết mồi có đặc hiệu hay không ?
Nếu mồi PCR không đặc hiệu và sản phẩm phụ hoặc primer-dimer hình thành (mồi tự bắt cặp với nhau và khuếch đại), hỗn hợp sau phản ứng chứa nhiều sản phẩm ADN có kích cỡ khác nhau. Mỗi sản phẩm ADN sẽ có nhiệt độ Tm riêng biệt do khác nhau về độ dài, thành phần GC…
Vì vậy, nếu bạn nhìn thấy nhiều đỉnh tín hiệu huỳnh quang trên melt curve, nhiều khả năng mồi của bạn không đặc hiệu.
Minh họa melting curve trong trường hợp ít sản phẩm phụ (trái) và nhiều sản phẩm phụ (phải)
2. Đầu dò đặc hiệu phát hiện đích đặc hiệu
Một phản ứng real time PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu sẽ yêu cầu một đầu dò gắn huỳnh quang cùng với mồi. Có một số dạng đầu dò như dưới đây.
2.1. Taqman probe qPCR
Một TaqMan® probes là một đầu dò đánh dấu kép có thể bị thủy phân và được thương mại độc quyền bởi hãng Roche Molecular Systems. TaqMan® probes sử dụng hoạt tính 5′ exonuclease của Taq polymerase để xác định số lượng trình tự đích. Đầu dò (probe) TaqMan là oligonucleotide dài 18 – 22 nu, được đánh dấu chất phát quang ở đầu 5’ và chất dập tín hiệu phát quang (quencher) ở đầu 3’.
Nguyên lý của một phản ứng định lượng bằng TaqMan probe
Nguyên lý định lượng bằng TaqMan Probe
Một oligonucleotide probe chứa một dye huỳnh quang báo cáo ở đầu 5’ và một dye dập tín hiệu (quencher) ở đầu 3’.
Khi probe nguyên vẹn, hai dye này ở khoảng cách đủ gần nhau, dye quencher làm tắt tín hiệu phát xạ của dye huỳnh quang bởi cơ chế FRET (Förster resonance energy transfer – truyền năng lượng cộng hưởng).
Ví dụ: reporter là FAM, TET, VIC thì quencher phù hợp là TAMRA ; Cy3, Cy5 với BHQ2.
Nếu trình tự DNA đích có mặt, probe gắn ở vị trí sau vị trí gắn của mồi và bị cắt bởi hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase khi phản ứng tổng hợp diễn ra. Sự cắt probe làm tách rời dye báo cáo khỏi quencher, nên tín hiệu phát quang của dye báo cáo được tạo ra, đồng thời cho phép polymerase kéo dài hết mạch khuôn.
Các phân tử dye báo cáo tiếp tục được tạo ra sau mỗi chu kỳ, làm tăng cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số bản sao được tạo ra.
* Ưu điểm: sự lai đặc hiệu của probe với đích là cần để sinh ra tín hiệu huỳnh quang ; probe có thể đánh dấu với các dye báo cáo khác nhau, cho phép khuếch đại và phát hiện 2 trình tự đích trong cùng một phản ứng.
* Nhược điểm: Tổng hợp các probe khác nhau đòi hỏi các trình tự khác nhau.
Cấu trúc của Taqman MGB probe
Taq man probe có thể là loại non-MGB probe hoặc MGB probe. Trong trường hợp Taqman non-MGB probe, để đảm bảo rằng chỉ bất cứ khi nào mồi bám được vào khuôn thì probe cũng phải gắn vào khuôn (tránh trường hợp mồi gắn mà probe không gắn thì phản ứng có diễn ra cũng không có tín hiệu huỳnh quang), non-MGB probe thường dài hơn mồi.
TaqMan MGB probes: chứa một phân tử bám vào rãnh xoắn nhỏ của DNA (MGB) ở đầu 3’ của probe. Khi probe bám vào trình tự đích, một rãnh nhỏ ngắn được hình thành trên DNA cho phép MGB tăng Tm vì thế làm chắc chắn sự bám của probe (tức là không cần làm probe dài mà vẫn bám chắc ở nhiệt độ Ta cần thiết cho mồi).
Vậy nên probe ngắn hơn mồi trong khi vẫn cho phép probe bám vào đích đặc hiệu hơn cả mồi khi ở nhiệt độ cao. Hơn nữa, vì có thể giảm độ dài của MGB probes nên chỉ một mismatch giữa probe và trình tự đích cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng bám, hạn chế trường hợp định lượng không đặc hiệu.
2.2. Molecular Beacon
Molecular beacon là một DNA mạch đơn dài 20 – 25 nu cũng được đánh dấu kép ở hai đầu như Taqman probe, ở trạng thái bình thường tạo thành cấu trúc kẹp tóc (stem-loop). Việc thiết kế molecular beacon yêu cầu 4 – 6 nu ở hai đầu của nó phải tạo thành cấu trúc kẹp tóc, trong khi phần loop khi biến tính thành dạng sợi thẳng cũng phải bám được vào trình tự DNA đích.
Molecular beacon và nguyên lý phát quang
Nguyên lý của một phản ứng định lượng bằng Molecular beacon
Trong bước gắn mồi của phản ứng PCR, phần loop của molecular beacon bám vào trình tự đích của nó, làm cho phần thân (stem) biến tính. Dye báo cáo và dye quencher tách xa nhau ra làm cho máy phát hiện được tín hiệu huỳnh quang của dye báo cáo. Số lượng trình tự đích qua từng chu kỳ phản ứng được thể hiện qua cường độ phát quang.
2.3. Scorpion primer
Scorpion primer là các phân tử hai chức năng, có mồi được gắn cộng hóa trị với probe. Phân tử này cũng chứa một chất phát quang và một dye quencher dập tắt tín hiệu. Nguyên lý định lượng sử dụng scorpion primer là giống với Taqman probe và molecular beacon, tuy nhiên cấu trúc có phần phức tạp hơn. Chúng tôi không đề cập thêm về loại mồi này, bạn có thể tìm hiểu thêm tại đây.
Cấu trúc của Scorpion priner
So sánh Taqman và SYBR Green
|
|
TaqMan®-Based Detection | SYBR®-Green Based Detection |
| Tổng quan | Dùng một probe đánh dấu huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu khi nó tích lũy dần qua các chu kỳ. | Dùng SYBR Green I dye, một dye bám đặc hiệu DNA mạch kép để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu khi nó tích lũy dần qua các chu kỳ. |
| Đặc hiệu | Chỉ phát hiện sản phẩm được khuếch đại đặc hiệu. | Phát hiện tất cả các DNA mạch đôi, bao gồm cả sản phẩm không đặc hiệu. |
| Ứng dụng |
|
|
| Ưu điểm |
|
|
| Nhược điểm | Mỗi probe phải thiết kế thêm cho mỗi trình tự đích nhất định | Có thể dương tính giả vì không phân biệt được sản phẩm không đặc hiệu. |
Một vài thông số khi phân tích kết quả Real time PCR
– Baseline : là mức độ tín hiệu trong các chu kỳ đầu, thường từ 3 đến 15 chu kỳ, trong đó chỉ có sự thay đổi nhỏ về tín hiệu huỳnh quang.
– Threshold (ngưỡng) : là mức độ tín hiệu phản ánh sự tăng đáng kể cương độ phát huỳnh quang so với tín hiệu baseline.
– Ct (chu kỳ ngưỡng) : số chu kỳ mà ở đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua threshold. Ct có liên hệ ngược với lượng khuôn DNA ban đầu nên dùng để tính toán số bản copy. DNA ban đầu càng ít thì Ct tăng.
– Đường chuẩn (standard curve) : như là một dạng đối chứng cho hiệu suất của mồi. Để lập đường chuẩn, thực hiện các phản ứng qPCR với nồng độ DNA khuôn thay đổi thành một dải. Ngoài ra đường chuẩn cho biết giới hạn phát hiện.
Đường chuẩn với các điểm tương đối tuyến tính
– Hệ số tương quan (R2) : đo lường mức độ trùng khớp của dữ liệu với đường chuẩn và phản ánh tính tuyến tính của đường chuẩn. Lý tưởng thì R2 = 1, mặc dù 0.999 thường là tối đa. Các điểm để dựng đường chuẩn càng phân bố không tuyến tính thì R2 càng lệch khỏi 1.
– Slope (độ dốc) : là một phép đo hiệu suất phản ứng .
– Hiệu suất (Effiiency) : Một phản ứng PCR có hiệu suất 100% ứng với slope là -3.32 theo công thức :
Các yếu tố có thể ảnh hưởng tới hiệu suất là độ dài, cấu trúc bậc hai và thành phần GC của đoạn khuếch đại, nồng độ các thành phần, chất lượng enzyme … và chất ức chế.
– Hiệu suất có thể trên 100%, đến 105% vẫn có thể chấp nhận được
Một số cải tiến trong Real time PCR
Multiplex real-time PCR
Trong Multiplex real-time PCR nên lưu ý thêm các yếu tố sau:
– Đầu dò
+ Tm của probe nên cao hơn khoảng 10oC so với Tm của mồi (vậy là cỡ 68-70oC)
+ Trình tự của MGB probe không thể chuyển đổi qua lại với trình tự QSY probe (loại probe sử dụng QSY quencher) bởi QSY probe sẽ trở nên quá ngắn
+ Không nên dùng quá 2 MGB-NFQ probes (Non Flourecent Quencher) trong một phản ứng multiplex để đảm bảo khuếch đại thành công, nhưng QSY probes có thể khuếch đại và định lượng 4 đích nhờ 4 dye khác nhau (FAM, VIC, ABY, và JUN dyes).
– Chọn các dye với ít hoặc không có sự chồng nhau phổ phát xạ ; chọn dye rõ nhất ( như FAM và ABY) cho đích kém phong phú hơn và dye tối nhất (VIC và JUN) cho đích phong phú hơn (ví dụ nội chuẩn dương)
– Multiplex real time PCR thường chỉ nên dùng với chỉ Taqman probe (có thể đến 4-plex) hoặc chỉ SYBR Green (có thể đến 3-plex).
Dual quencher probe real time PCR
Internal ZEN/TAO quencher cung cấp khả năng dập tín hiệu tốt hơn và hạ thấp tín hiệu nền ban đầu (Ct không đổi). Probe thông thường bị giới hạn độ dài do khoảng cách giữa R và Q không thể quá lớn thì dual quencher có thể khắc phục được.
Cấu trúc của đầu dò 2 quencher (dual quencher probe)
Taqman Locked Nucleic Acid (LNA) probe
LNA là một loại đồng phân acid nucleic chứa cầu 2′-O, 4′-C methylene. Khóa cầu này tạo ra cấu trúc hai vòng cứng ngắc, vòng ribofuranose kém linh hoạt hơn
- Tăng độ bền nhiệt và độ đặc hiệu lai
- Định lượng gen và phân biệt alen chính xác hơn
- Thiết kế đầu dò dễ hơn và linh hoạt hơn cho các trình tự khó.
miRNA RT-PCR
– Vì miRNA quá ngắn, để nguyên như vậy không thể phiên mã ngược được nên phải làm miARN dài ra trước.
– Một cách là dùng mồi dạng kẹp tóc:
+ Chỉ một phần ngắn bắt cặp với miRNA, nhưng mồi này đủ bám do Tm một phần đến từ phần thân kẹp (thiết kế thân kẹp giàu GC sẽ tăng Tm).
+ Sau đó thực hiện real-time PCR với cDNA dài hơn miRNA. Probe cũng là MGB probe để làm ngắn probe.
Các bước trong định lượng miARN- Cách khác là kéo dài polyA
+ miRNA được kéo dài bằng PolyA polymerase
+ miRNA được phiên mã ngược với mồi oligoT gắn trình tự bám mồi universal (đầu 5’)
+ real time PCR với một mồi đặc hiệu miRNA, một mồi.
Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR trong Y tế
CMV Real-time PCR
Phát hiện DNA virus Cytomegalovirus (CMV). CMV là tác nhân sinh bệnh nhiễm trùng cơ hội và nguy cơ bệnh CMV tùy thuộc sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. CMV còn là một trong những nguyên nhân gây mhiễm trùng bẩm sinh thường gặp ở thai phụ – nhiễm trùng Torch gây nguy hại cho thai nhi.
EBV Real-time PCR
Phát hiện DNA virus Epstein-Barr (EBV). EBV được biết đến như là nguyên nhân của bệnh bạch cầu đơn thuần (mononucleosis). EBV cũng liên quan với một số dạng đặc biệt của ung thư, chẳng hạn như u lympho Hodgkin; u lympho Burkitt; ung thư dạ dày; ung thư biểu mô vòm họng và các tình trạng liên quan đến virus gây suy giảm miễn dịch ở người bệnh (HIV) và u lympho của hệ thần kinh trung ương.
Adenovirus Real-time PCR
Phát hiện DNA virus Adenovirus. Adenovirus có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan khác nhau trên cơ thể như đường hô hấp, đường tiêu hóa, mắt, tiết niệu và ở gan. Trong số 6 nhóm gồm 47 type huyết thanh gây bệnh đã biết, nhóm B là nhóm có khả năng gây bệnh nhiều và hay gặp nhất. Nhiễm Adenovirus thường là nhiễm một type, chiếm khoảng 5% nhiễm virus hô hấp cấp tính ở trẻ em, virus này còn thường gặp trong bệnh lý nhiễm virus ở mắt và đường tiêu hóa.
HPV genotype Real-time PCR
Real-time PCR là phương pháp tốt nhất để chẩn đoán HPV, cho phép thực hiện một nghiên cứu và thu được kết quả nhanh chóng. Ngoài ra, Real-time PCR cho phép không chỉ sàng lọc mà còn cho phép nghiên cứu định lượng virus HPV.
Multiplex real-time PCR sử dụng các Taqman probe đặc hiệu 20 genotype HPV thường gặp bao gồm 14 genotype thuộc nhóm “HIGH RISK” và 6 genotype thuộc nhóm “LOW RISK”. Multiplex real-time PCR cho phép phát hiện và định genotype HPV có trong các mẫu thử (sinh thiết, quệt cổ tử cung, dịch ThinPrep còn lại sau làm phết một các đơn giản và nhanh chóng với kết quả đến tay bác sĩ chỉ 4 đến 6 giờ sau khi nhận mẫu. Có hai loại xét nghiệm để bác sĩ lựa chọn:
- Phát hiện và xác định nhóm HIGH RISK/LOW RISK: Với xét nghiệm này, kết quả mà bác sĩ sẽ nhận được là (1) mẫu thử có HPV hay không, nếu có thì thuộc vào nhóm HIGH RISK hay LOW RISK; (2) nếu là nhóm HIGH RISK thì có phải là genotype 16 hay 18 không; (3) nếu thuộc nhóm LOW RISK thì có phải là genotype 6 hay 11 không.
- Phát hiện và xác định genotype của HPV: Với xét nghiệm này thì kết quả mà bác sĩ sẽ nhận được là (1) mẫu thử có HPV hay không, nếu có thì thuộc vào nhóm HIGH RISK hay LOW RISK; (2) nếu là nhóm HIGH RISK thì thuộc genotype nào trong các genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68; (3) nếu thuộc nhóm LOW RISK thì có phải là genotype 6 hay 11 không.
Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR trong Thủy sản
Trong lĩnh vực thủy sản, đặc biệt là ngành nuôi tôm công nghiệp đang phải đối mặt với nhiều rủi ro, trong đó, dịch bệnh nguy hiểm trên tôm như bệnh đốm trắng trên tôm, EMS, EHP, IMNV, YHV… đã gây ra thiệt hại kinh tế rất nghiêm trọng.
Trước thực trạng trên, kỹ thuật Realtime PCR được đánh giá là công cụ hữu hiệu và được sử dụng phổ biến giúp chẩn đoán sớm và phòng ngừa sự lây lan dịch bệnh. Đồng thời, kỹ thuật Realtime PCR còn giúp kiểm soát tốt mầm bệnh nguồn giống đầu vào và các mặt hàng tôm xuất khẩu theo yêu cầu của các nước nhập khẩu như Úc, Hàn Quốc, EU, Mỹ…
Một số bệnh ở tôm có thể phát hiện bằng Real-time PCR:
- Bệnh đốm trắng trên tôm (WSSV)
- Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (AHPND/EMS)
- Bệnh vi bào tử trùng trên tôm (EHP)
- Bệnh hoại tử cơ trên tôm (IMNV)
- Bệnh còi do virus Monodon baculovirus (MBV)
- Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV)
- Hội chứng Taura trên tôm (TSV)
- Bệnh đầu vàng trên tôm (YHV)
- Bệnh do vi khuẩn gây hoại tử gan tụy (NHPB).
Như vậy, khi đọc đến đây, chắc hẳn các bạn đã có được những khái niệm cơ bản đủ để giải đáp câu hỏi Real-time PCR là gì?
Đây là một trong những kỹ thuật nền của Sinh học phân tử nên mặc dù đã được ra đời cách đây đã lâu nhưng cho đến thời điểm hiện tại, Real-time PCR vẫn liên tục được cải tiến để đem đến những hiệu quả cao hơn trong các ứng dụng chuyên ngành.
Tài liệu tham khảo
Sigma aldrich, Bio-rad, Thermofisher Scientific
Đọc thêm:
iceberg (tổng hợp)
tapchisinhhoc.com
No Responses