Tế bào khả biến cho 9 ứng dụng tách dòng

Các tế bào khả biến (tế bào khả nạp) là các tế bào được thiết kế để nhận DNA ngoại lai từ bên ngoài với hiệu quả cao hơn, thường được sử dụng trong tách dòng phân tử để nhân bản và duy trì các mảnh DNA trong plasmid. Bài viết này bao gồm các yếu tố cần thiết của việc chọn các tế bào khả biến để cho phép tăng khả năng thành công trong các ứng dụng sinh học phân tử sau đây:

1. Biểu hiện protein trong tế bào vi khuẩn

Escherichia coli là một trong những vật chủ phổ biến nhất dùng để biểu hiện protein vì sự tăng trưởng nhanh và hiệu quả. Các chủng E. coli được sử dụng rộng rãi nhất trong biểu hiện của protein là BL21 và các chủng biến đổi của nó.

Điều này chủ yếu là do các chủng BL21 bị thiếu protease nội bào (Lon) và một protease ngoại màng (OmpT). Cả hai đột biến này (lon và ompT) cho phép tích lũy trong tế bào các protein dị hoại (protein có nguồn gốc từ các loài khác hoặc từ loại tế bào khác nhau về vật chủ) với tốc độ cao trong khi hạn chế sự thoái hóa protein trong quá trình tinh sạch [1].

Các RNA polymerase nội sinh của tế bào chủ biểu hiện các gen trên plasmid biến nạp, bao gồm cả gen được tách dòng (gen nhân bản), có thể được điều khiển bởi một promotor như lac hoặc tac. Tuy nhiên, các promotor này tương đối yếu và do đó không lý tưởng cho sự biểu hiện mạnh mẽ của gen nhân bản. Do đó, các chủng BL21 có thể được sửa đổi để mang promotor của thực khuẩn thể T7 để tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp [2].

T7 promotor có mặt trong vector pET được dùng cực kỳ rộng rãi trong biểu hiện, được nhận biết bởi phage T7 RNA polymerase (T7 RNAP).

Polymerase hoạt động mạnh này có thể được dùng cho plasmid khác, hoặc phổ biến nhất, nó được đặt trong genome vi khuẩn (λDE3) để mã hóa cho T7 RNAP (dưới sự kiểm soát phiên mã của  một lacUV5 promotor).

Vì thế hệ thống có thể được cảm ứng bằng lactose hoặc IPTG. Hệ thống BL21 (DE3) với promotor T7 thường gây ra mức độ biểu hiện cơ sở (biểu hiện nền) của các gen dị hoại cao hơn so với chủng BL21. Điều này sẽ thật chẳng hay ho nếu như protein dị hoại có tính chất gây độc tế bào.

Mức độ biểu hiện cơ sở có thể được kiểm soát bằng lacI^Q (điều hòa lacUV5 promotor) nhưng cũng có thể nhờ sự đồng biểu hiện của T7 lysozyme:

T7 lysozyme có khả năng bám vào T7 RNAP, thế nên ức chế sự khởi đầu phiên mã ở T7 promotor.

Bằng cách này nếu lượng nhỏ T7 RNAP được tạo ra ‘lỉ rỉ’, T7 lysozyme sẽ kiểm soát hiệu quả, gene ngoại lai nằm sau T7 promotor không biểu hiện được.  

T7 lysozyme được cung cấp bởi một plasmid tương hợp (pLysS hoặc pLysE).

Sau khi gây cảm ứng có chủ đích, lượng T7 RNAP được tạo ra vượt trội khả năng ức chế của T7 lysozyme, lượng T7 RNAP tự do vì thế có thể bắt đầu phiên mã gene tái tổ hợp.

Còn một cách điều hòa dựa vào sự chèn một lacO operator phía sau T7 promotor, làm tạo ra một promotor lai T7/lac.

Cả 3 cơ chế này (điều hòa chặt chẽ bởi gene T7 RNAP có thể cảm ứng lac bởi lacI^Q, sự ức chế T7 RNAP bởi T7 lysozyme và sự có mặt của một lacO sau T7 promotor) làm cho hệ thống thật lý tưởng để tránh sự biểu hiện cơ sở mà vẫn đảm bảo khả năng biểu hiện mạnh khi muốn.

Để tăng cường biểu hiện RNA mạnh từ T7 promotor, chủng BL21 (DE3) có thể được sửa đổi thêm về mặt di truyền để tăng tính ổn định của mRNA.

Một ví dụ là đột biến gen rne, mã hóa một endonuclease thiết yếu, RNase E. RNase E có liên quan đến sự trưởng thành của rRNA và sự thoái biến mRNA như là một thành phần của phức hợp protein ‘degradosome’.

Đột biến rne131 dẫn đến RNase E bị cắt ngắn, làm hạn chế sự thoái hóa mRNA [3-5]. Do đó, chủng BL21với rne131 làm tăng tính ổn định của các bản phiên mã mRNA, rốt cuộc tăng biểu hiện protein.

Bảng 1. Các ảnh hưởng của pLysS và pLysE lên T7 lysozyme, tế bào chủ và sự biểu hiện của gen được tách dòng

2. Nhân bản các cấu trúc DNA mang trình tự lặp

Một số cấu trúc DNA có xu hướng tái tổ hợp và do đó không ổn định trong các tế bào vi khuẩn sau khi ta biến nạp. Ví dụ về các cấu trúc plasmid như vậy bao gồm các vectơ retrovirus và lentivirus, chứa các chuỗi lặp lại dài ở đầu tận cùng (LTR), lặp lại ngược chiều và lặp liên tục.

Các tế bào khả biến mang đột biến recA1 hoặc recA13 hoặc cả hai được sử dụng rộng rãi để nhân dòng ổn định các cấu trúc biến nạp trong vector retrovirus và lentivirus.

Đột biến gen recA của vật chủ làm cho enzyme tham gia vào quá trình sửa chữa DNA không hoạt động, do đó làm hạn chế hiện tượng tái tổ hợp và cho phép duy trì các cấu trúc bất ổn định.

Đột biến recA cũng ngăn ngừa sự tái tổ hợp tương đồng giữa nhiễm sắc thể của tế bào chủ và vector. Tuy nhiên, đột biến recA là không đủ để ngăn chặn hiện tượng mất và tái tổ hợp các trình tự DNA lặp, do đó, các tế bào khả biến chuyên biệt có khả năng ổn định các cấu trúc DNA lặp phải được xem xét (Hình 3) [23-26].

Tính ổn định của cấu trúc DNA có thể được tăng cường hơn nữa bằng cách thực hiện như sau:

• Ủ các tế bào ở 30 ° C trong 90 phút để phục hồi tế bào sau khi biến nạp.
• Sau khi cấy các tế bào trên các đĩa thạch LB, để đĩa ở 30 ° C.
• Sử dụng các khuẩn lạc từ các đĩa cấy không quá 4 ngày sau khi biến nạp.
• Cấy chuyển các khuẩn lạc biến nạp vào môi trường Terrific Broth (môi trường TB) ở 30 ° C để bắt đầu và nuôi cấy thể tích lớn để tách plasmid.
• Thu môi trường nuôi vi khuẩn để tách DNA trong hoặc trước pha bão hòa (pha cân bằng) của quá trình nuôi cấy.

3. Nhân dòng các plasmid lớn

Các plasmid lớn (> 10 kb) được biết là gây ra các vấn đề trong quá trình biến nạp vào vi khuẩn, vì hiệu suất biến nạp có xu hướng giảm khi kích thước plasmid tăng [28,29]. Các khuyến nghị để tăng khả năng thành công của việc biến nạp các plasmid lớn bao gồm:

• Chọn các tế bào khả biến với hiệu suất biến nạp cao hơn (> 1 x 10^9 CFU/ug) để biến nạp các plasmid 10 – 30 kb.
• Cân nhắc việc biến nạp bằng điện thay vì sốc nhiệt để mang lại hiệu suất biến nạp cao hơn.
• Đối với cấu trúc DNA > 30 kb (ví dụ: cosmids), chọn các tế bào khả biến chuyên biệt.
• Xem xét các tế bào khả biến mang đột biến deoR, giúp cải thiện việc duy trì các cấu trúc DNA lớn [30,31].

4. Nhân dòng các vector mang gen gây chết ccdB

Một trong những phương pháp sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid mong muốn là chọn lọc dương tính.

Trong phương pháp này, vectơ chứa một gen gây chết trong khu vực đa điểm tách dòng (MCS). Nếu chèn thành công đoạn mong muốn vào vec-tơ (tại vị trí MSC) sẽ làm gián đoạn sự biểu hiện của gen gây chết và vì thế cho phép vi khuẩn hình thành khuẩn lạc.

Gen ccdB, có nguồn gốc từ F ′ episome (episome là yếu tố di truyền bên trong vi khuẩn có khả năng nhân lên độc lập với DNA nhiễm sắc thể), là một trong những gen gây chết được sử dụng để sàng lọc dương tính và đóng vai trò là điểm đánh dấu có thể chọn lọc trong nhiều vectơ tách dòng [32,33].

Protein CcdB là một độc tố can thiệp vào bước nối lại của DNA gyrase, khiến nhiễm sắc thể của vật chủ bị phân mảnh và kìm hãm sự phát triển của tế bào. Để nhân lên các vectơ tách dòng mang gen ccdB, các tế bào chủ phải chống lại các tác động độc hại của CcdB.

Hầu hết các chủng kháng CcdB mang gyrA462, một đột biến trong DNA gyrase, ngăn chặn sự phá vỡ DNA sợi đôi gây bởi protein CcdB [34].

Lưu ý rằng còn có các chủng vi khuẩn mang F ′ episome có gen ccdA, điều hòa ngược ccdB [35].

Tuy nhiên, không nên sử dụng các tế bào khả biến F’ để truyền vectơ ccdB, vì biểu hiện nội sinh của protein CcdA tồn tại trong thời gian ngắn có thể không thể ức chế tác động gây chết của CcdB.

Ngược lại, khi sử dụng vectơ ccdB để chọn lọc dương, nên sử dụng các chủng F- để biến nạp để tránh biểu hiện ccdA và ngăn chặn sự tồn tại của các khuẩn lạc không có DNA nhân bản.

5. Nhân bản plasmid với R6Kγ ori

Một số plasmid mang điểm khởi đầu sao chép đặc biệt được gọi là R6Kγ. Để sao chép các plasmid này ở vi khuẩn, các tế bào khả biến phải biểu hiện protein pi (π) để liên kết với trình tự R6Kγ và bắt đầu sao chép các plasmid. Protein π được mã hóa bởi các gen pir.

Có hai loại tế bào khả biến với gen pir: pir+ (chủng hoang dại) và pir-116 (đột biến) [36].

• tế bào pir+ lưu giữ được plasmid R6Kγ đến khoảng 15 bản sao trên mỗi tế bào, rất tốt cho việc duy trì cấu trúc biến nạp và biểu hiện một gen tách dòng gây độc tính.
• tế bào pir-116 lưu giữ plasmid đến 250 bản sao trên mỗi tế bào, thích hợp hơn cho việc tách dòng và tinh sạch cấu trúc biến nạp.

Một số hệ thống nhân bản plasmid R6Kγ nhất định, chẳng hạn như hệ thống Univector (Hình 5) [37], sử dụng hệ thống tái tổ hợp Cre-lox.

Protein Cre recombinase, khi được cung cấp, liên kết với vị trí loxP trên Univector. Điều này ảnh hưởng đến sự tái tổ hợp của các plasmid cho và plasmid nhận, tạo ra một phiên bản tái tổ hợp mang gen quan tâm [38].

6. Tạo ra DNA mạch đơn bằng tách dòng

DNA mạch đơn (ssDNA) rất hữu ích cho giải trình tự DNA dideoxy, chuẩn bị các đầu dò đặc hiệu, gây đột biến in vitro và xây dựng các thư viện cDNA.

Một cách tiếp cận dựa trên tách dòng khá phổ biến để tạo ssDNA liên quan đến việc tận dụng chu kỳ sao chép của thực khuẩn thể M13 (Hình 6) [39-45].

Để thực khuẩn thể M13 bám vào và xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, chủng E. coli phải biểu thị F pilus, ký hiệu là F ′ hoặc F +.

Để tạo ssDNA, dsDNA quan tâm có thể được tách dòng vào (1) vectơ M13 hoặc (2) phagemid (Hình 7, 8).

1. Các vectơ M13 là dạng chuỗi kép của hệ gen thực khuẩn thể M13 (dạng này còn được gọi là dạng sao chép, hay RF), được sửa đổi để mang vị trí đa điểm cắt (MCS) cho phép chèn gen quan tâm [46,47]. Sau khi biến nạp tế bào, các vectơ M13 nhân lên thành các dạng phage trung gian và cuối cùng tạo thành các ssDNA.

Các ssDNA được đóng gói thành các hạt phage M13, như trong chu trình sao chép M13. Do đó, ssDNA có thể được tinh sạch từ các hạt phage trong môi trường nuôi cấy trong khi dsDNA vẫn còn bên trong các tế bào. Tuy nhiên, tách dòng đoạn DNA hơn 2 kb vào vectơ M13 có xu hướng kém ổn định hơn và nhiều thách thức.

2. Một phagemid là một cách tiếp cận khác để nhân dòng các chuỗi DNA lớn. Phagemids được tạo nên từ các trình tự plasmid cùng với MCS và điểm khởi đầu sao chép (rep) đồng thời mang cả điểm khởi đầu sao chép của phage (f1 ori) (Hình 8A).

Sau khi biến nạp, các tế bào khả biến F’ nhân lên và duy trì phagemids mang DNA tách dòng y như plasmid. Chỉ khi bị lây nhiễm với một phage trợ giúp (ví dụ: M13KO7), các tế bào mới tạo ra các hạt phage ssDNA từ phagemid, bởi vì phage trợ giúp mang các gen cần thiết cho đóng gói phage M13.

Bản thân các phage trợ giúp không đủ khả năng trong việc tự đóng gói do thay thế f1 ori bằng một điểm khởi đầu sao chép của plasmid (ví dụ: p15A ori, Hình 8B) [48].

Như vậy, bất kỳ chủng E. coli nào có episome F’ có thể được sử dụng để tạo ssDNA thông qua con đường sao chép M13.

Tuy nhiên, nhiễm DNA plasmid vi khuẩn hoặc phagemid sợi đôi có thể cản trở việc chuẩn bị ssDNA chất lượng cao từ các chủng này.

Do đó, nên sử dụng các chủng là endA+ (ngoài chủng F′) để loại bỏ dsDNA trong quá trình tinh sạch ssDNA (Hình 9).

7. Tạo ra các bacmids tái tổ hợp để biểu hiện gen trong tế bào côn trùng

Biểu hiện protein trong các tế bào côn trùng mang lại một số lợi thế nhất định, chẳng hạn như cải biến sau dịch mã giống như các tế bào động vật có vú và dễ dàng mở rộng quy mô.

Baculovirus, lây nhiễm tế bào côn trùng, được sử dụng để đưa gen tái tổ hợp vào tế bào côn trùng [49].

Một phương pháp để tạo ra baculovirus là bằng cách truyền bacmid vào tế bào côn trùng, đó là một plasmid con thoi giữa E. coli và tế bào côn trùng, mang gen quan tâm [50].

Một bacmid tái tổ hợp có thể được xây dựng ở E. coli bằng cách biến nạp vào các tế bào khả biến chứa một bacmid bố mẹ và một plasmid transposon hỗ trợ (helper) cùng một plasmid cho (donor) được thiết kế đặc biệt để mang gen quan tâm (Hình 10).

8. Nhân bản DNA thực vật để chuyển gen

DNA tái tổ hợp thường xuyên được đưa vào tế bào thực vật một cách dễ dàng và đơn giản bằng một quá trình dựa vào vi khuẩn Agrobacterium [51].

Theo cách này, các tế bào Agrobacterium tumefaciens được biến nạp với DNA thực vật đã được tách dòng thành một plasmid gây ra khối u, hay Ti plasmid, plasmid này được sửa đổi để chuyển gen vào tế bào thực vật [52].

Ưu điểm của phương pháp:

Một Ti plasmid giản lược, còn được gọi là plasmid vir hỗ trợ, chỉ mang các thành phần thiết yếu để chuyển DNA [53].

Đối với Ti plasmid tự nhiên, hầu hết các T-DNA (một phần của Ti plasmid), được chuyển vào các tế bào thực vật, khá lớn (~ 25 kb), không chứa các vị trí cắt giới hạn để nhân bản và được coi là không cần thiết cho việc chuyển gen (Hình 11A).

Vùng T-DNA bị loại bỏ và chỉ các đoạn thiết yếu (như vir, ori, LB, RB) được giữ lại để tạo ra một Ti plasmid dễ thao tác hơn (Hình 11B). pAL4404 là một Ti plasmid giản lược thường được sử dụng.

Trình tự mong muốn có thể được nhân bản thành một vectơ con thoi như pBI121, có thể sao chép trong cả A. tumefaciens và E. coli [54].

Vectơ con thoi chứa một T-DNA nhỏ hơn với các trình tự biên LB và RB, cùng với một vị trí tách dòng và một chỉ thị sàng lọc (Hình 12C).

Gen mong muốn có thể được nhân bản vào vectơ con thoi nằm giữa LB, RB và được nhân lên ở E. coli; sau đó A. tumefaciens có thể được biến nạp với một Ti plasmid giản lược để chuyển gen.

Điện biến nạp trên A. tumefaciens mang lại hiệu quả biến nạp cao hơn với ít bước hơn và ít thời gian hơn mà lại hạn chế nguy cơ nhiễm E. coli [55].

9. Xây dựng thư viện DNA

Hiệu suất biến nạp và kiểu gen của vật chủ đặc biệt quan trọng đối với việc xây dựng thư viện DNA để tạo ra một thư viện đại diện bao gồm các gen mang tính phong phú và kích cỡ khác nhau.

Trong quá trình chuẩn bị một thư viện, gộp chung các chèn DNA bão hòa (các đoạn gDNA hoặc cDNA) đã được gấn vào các vectơ được sử dụng để biến nạp vào các tế bào khả biến.

Lượng bão hòa DNA giúp tối đa hóa kích thước thư viện với DNA đại diện từ số lượng tối thiểu các phản ứng biến nạp, nhưng làm giảm suất tiếp nhận DNA của các tế bào.

Do đó, khi chọn các tế bào khả biến để xây dựng thư viện, chủng tế bào gây khả biến bằng điện và có hiệu suất biến nạp cao nhất được khuyến nghị để thu được số lượng lớn nhất các thể biến nạp từ một lần biến nạp duy nhất.

Ngoài hiệu suất biến nạp, kiểu gen của các tế bào khả biến được chọn là một khía cạnh quan trọng trong việc chuẩn bị thư viện và cần lưu ý các chỉ thị (marker) di truyền sau (Bảng 4).

Tóm lại, các thí nghiệm tách dòng phân tử thường yêu cầu các tế bào khả biến với các tính chất nhất định để biến nạp. Để tiết kiệm thời gian và công sức, điều quan trọng là chọn được các tế bào khả biến được thiết kế phù hợp cho các ứng dụng mong muốn.

Tài liệu tham khảo

1. Samuelson JC (2011) Recent developments in difficult protein expression: a guide to E. coli strains, promoters, and relevant host mutations. Methods Mol Biol 705:195–209.
2. Studier FW, Rosenberg AH, Dunn JJ (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol 185:60–89.
3. Kido M, Yamanaka K, Mitani T et al. (1996) RNase E polypeptides lacking a carboxyl-terminal half suppress a mukB mutation in Escherichia coli. J Bacteriol 178(3):3917–3925.
4. Grunberg-Manago, M (1999) Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu Rev Genet 33:193–227.
5. Lopez PJ, Marchand I, Joyce SA et al. (1999) The C-terminal half of RNase E, which organizes the Escherichia coli degradosome, participates in mRNA degradation but not rRNA processing in vivo. Mol Microbiol 33(1):188–199.
6. Moffatt BA, Studier FW (1987) T7 lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polymerase. Cell 49(2):221–227.
7. Studier FW (1991) Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol 219(1):37–44.
8. Miyada CG, Stoltzfus L, Wilcox G (1984) Regulation of the araC gene of Escherichia coli: catabolite repression, autoregulation, and effect on araBAD expression. Proc Natl Acad Sci U S A 81(13):4120–4124.
9. Lee N, Francklyn C, Hamilton EP (1987) Arabinose-induced binding of AraC protein to araI2 activates the araBAD operon promoter. Proc Natl Acad Sci U S A 84(24):8814–8818.
10. Lautenberger JA, Kan NC, Lackey D (1978) Recognition site of Escherichia coli B restriction enzyme on phi XsB1 and simian virus 40 DNAs: an interrupted sequence. Proc Natl Acad Sci U S A 75(5):2271–2275.
11. Kan NC, Lautenberger JA, Edgell MH (1979) The nucleotide sequence recognized by the Escherichia coli K12 restriction and modification enzymes. J Mol Biol 130(2):191–209.
12. Murray NE (2000) Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle). Microbiol Mol Biol Rev 64(2):412–434.
13. Geier GE, Modrich P (1979) Recognition sequence of the dam methylase of Escherichia coli K12 and mode of cleavage of Dpn I endonuclease. J Biol Chem 254(4):1408–1413.
14. Buryanov YI, Bogdarina IG, Bayev AA (1978) Site specificity and chromatographic properties of E. coli K12 and EcoRIIDNA-cytosine methylases. FEBS Lett 88(2):251–254.
15. Costello JF, Plass C (2001) Methylation matters. J Med Genet 38(5):285–303.
16. Adams RL (1995) Eukaryotic DNA methyltransferases–structure and function. Bioessays 17:139–145.
17. Raleigh EA, Wilson G (1986) Escherichia coli K-12 restricts DNA containing 5-methylcytosine. Proc Natl Acad Sci U S A 83(23):9070–9074.
18. Raleigh EA, Benner J, Bloom F et al. (1991) Nomenclature relating to restriction of modified DNA in Escherichia coli. J Bacteriol 173(8):2707–2709.
19. Dila D, Sutherland E, Moran L (1990) Genetic and sequence organization of the mcrBC locus of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 172(9):4888–4900.
20. Stewart FJ, Raleigh EA (1998) Dependence of McrBC cleavage on distance between recognition elements. Biol Chem379(4–5):611–616.
21. Kelleher JE, Raleigh EA (1991) A novel activity in Escherichia coli K-12 that directs restriction of DNA modified at CG dinucleotides. J Bacteriol 173(16):5220–5223.
22. Waite-Rees PA, Keating CJ, Moran LS et al. (1991) Characterization and expression of the Escherichia coli Mrr restriction system. J Bacteriol 173(16):5207–5219.
23. Lovett ST, Drapkin PT, Sutera VA Jr (1993) A sister-strand exchange mechanism for recA-independent deletion of repeated DNA sequences in Escherichia coli. Genetics 135(3):631–642.
24. Trinh T, Jessee J, Bloom FR et al. (1994) Stbl2: An Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus 16(3):78–80.
25. Bi X, Liu LF (1996) A replicational model for DNA recombination between direct repeats. J Mol Biol 256(5):849–958.
26. Schmidt BJ, Bloom FR. (1999) ElectroMAX Stbl4 cells for stable maintenance of repeat sequences. Focus 21(2):52–53.
27. Leonardo ED, Sedivy JM (1990) A new vector for cloning large eukaryotic DNA segments in Escherichia coli. Biotechnology (N Y) 8(9):841–844.
28. Leonardo ED, Sedivy JM (1990) A new vector for cloning large eukaryotic DNA segments in Escherichia coli. Biotechnology (N Y) 8(9):841–844.
29. Siguret V, Ribba AS, Chérel G (1994) Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques 16(3):422–426.
30. Hanahan D (1989) US Patent 4,851,348.
31. Durfee T, Nelson R, Baldwin S et al. (2008) The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B: insights into the biology of a laboratory workhorse. J Bacteriol 190(7):2597–2606.
32. Bernard P, Gabant P, Bahassi EM et al. (1994) Positive-selection vectors using the F plasmid ccdB killer gene. Gene 148(1):71–74.
33. Bernard P (1996) Positive selection of recombinant DNA by CcdB. Biotechniques 21(2):320–323.
34. Bernard P, Couturier M (1992) Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. J Mol Biol 226(3):735–745.
35. Bernard P, Kézdy KE, Van Melderen L et al. (1993) The F plasmid CcdB protein induces efficient ATP-dependent DNA cleavage by gyrase. J Mol Biol 234(3):534–541.
36. Metcalf WW, Jiang W, Wanner BL (1994) Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138(1-2):1-7.
37. Marsischky G, LaBaer J (2004) Many paths to many clones: a comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res (10B):2020–2028.
38. Liu Q, Li MZ, Liu D, Elledge SJ (2000) Rapid construction of recombinant DNA by the univector plasmid-fusion system. Methods Enzymol 328:530–549.
39. Zagursky RJ, Berman ML (1984) Cloning vectors that yield high levels of single-stranded DNA for rapid DNA sequencing. Gene 27(2):183–191.
40. Nakagami S, Matsunaga H, Miyoshi K et al. (1991) Nonradioactive detection of nucleic acid by the universal probe system. Anal Biochem 192(1):11–16.
41. Carter P (1987) Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors Methods Enzymol 154:382–403.
42. McClary JA, Witney F, Geisselsoder J (1989) Efficient site-directed in vitro mutagenesis using phagemid vectors. Biotechniques 7(3):282–289.
43. Duguid JR, Rohwer RG, Seed B (1988) Isolation of cDNAs of scrapie-modulated RNAs by subtractive hybridization of a cDNA library. Proc Natl Acad Sci U S A 85(15):5738–5742.
44. Rubenstein JL, Brice AE, Ciaranell RD et al. (1990) Subtractive hybridization system using single-stranded phagemids with directional inserts. Nucleic Acids Res 18(16):4833–4842.
45. Klickstein LB (2001) Production of a subtracted cDNA library. Curr Protoc Mol Biol Chapter 25: Unit 25B.1. 
46. Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33(1):103–119.
47. Messing J (1991) Cloning in M13 phage or how to use biology at its best. Gene 100:3–12.
48. Vieira J, Messing J (1987) Production of single-stranded plasmid DNA. Methods Enzymol 153:3–11.
49. Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL (2005) Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol 23(5):567–575.
50. Luckow VA, Lee SC, Barry GF (1993) Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol67(8):4566-79.
51. Hoekema A, Roelvink PW, Hooykaas PJ et al. (1984) Delivery of T-DNA from the Agrobacterium tumefaciens chromosome into plant cells. EMBO J 3(11):2485–2490.
52. Lee LY, Gelvin SB (2008) T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol 146(2):325–332.
53. Hoekema A, van Haaren MJ, Fellinger AJ (1985) Non-oncogenic plant vectors for use in the agrobacterium binary system. Plant Mol Biol 5(2):85–89.
54. Bevan M (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12(22):8711–8721.
55. Shen WJ, Forde BG (1989) Efficient transformation of Agrobacterium spp. by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 17(20):8385.
56. Lin JJ (1994) Optimization of the transformation efficiency of Agrobacterium tumefaciens cells using electroporation. Plant Sci 101(1):11–15.
57. Jespers LS, Messens JH, De Keyser A (1995) Surface expression and ligand-based selection of cDNAs fused to filamentous phage gene VI. Biotechnology (N Y) 13(4):378–382.
58. Laird-Offringa IA, Belasco JG (1996) In vitro genetic analysis of RNA-binding proteins using phage display libraries. Methods Enzymol 267:149-68.
59. Oh MY, Joo HY, Hur BU (2007) Enhancing phage display of antibody fragments using gIII-amber suppression. Gene386(1-2):81–89.
60. Clarke L, Carbon J (1976) A colony bank containing synthetic Col El hybrid plasmids representative of the entire E. coli genome. Cell 9(1):91–99.
61. William JG (1981) The Preparation and Screening of a cDNA Clone Bank. In: Williamson R (editor), Genetic Engineering. New York: Academic Press. p 6.
62. Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM (1984) Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature312(5992):342–347.
63. Wood WI, Capon DJ, Simonsen CC et al. (1984) Expression of active human factor VIII from recombinant DNA clones. Nature 312(5992):330–337.
64. Donahue RA., Bloom FR (1998) Large-volume transformation with high-efficiency chemically competent cells. Focus 20(2):54–56.
65. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR (1991) Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol 204:63–113.

Các hình ảnh trừ hình 1 được đăng tải bởi thermofisher.com

iceberg (biên tập)

tapchisinhhoc.com

Đọc thêm

Tách dòng phân tử căn bản
13 phương pháp chuyển gen phổ biến