Giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq)

Giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq)

Giải trình tự ARN đơn tế bào là gì?

Mô hình biểu hiện gen của một tế bào xác định thành phần protein của tế bào đó. Về cơ bản, tất cả các tế bào trong cơ thể người chứa một tập hợp như nhau gồm khoảng 20.000 gen, nhưng các tế bào khác nhau sẽ khác biệt về tập hợp các gen được biểu hiện, dẫn đến khác biệt giữa các tế bào về thành phần trên màng, kênh vận chuyển ion, các yếu tố của bộ khung tế bào, các nhân tố tăng trưởng, các thụ thể và các nhân tố phiên mã. Hồ sơ biểu hiện gen vì thế mô tả chi tiết và tinh tế kiểu hình của tế bào, điều này nhấn mạnh vai trò phân tử của nó.

Trong lịch sử, các nghiên cứu biểu hiện gen đã được giới hạn trong việc phân tích các quần thể tế bào, đây là yêu cầu để có đủ ARN cho phân tích. Ví dụ, mô hình biểu hiện kết hợp của tất cả các tế bào thuộc một khối u cần phải được kiểm tra tổng hợp để xác định các con đường phân tử bị nhiễu loạn. Tuy nhiên, một khối u chứa tập hợp các tế bào không đồng nhất, bao gồm các tế bào mạch, nguyên bào sợi, các tế bào miễn dịch thâm nhập và các tế bào ung thư phân chia nhanh cũng như các tế bào gốc ung thư, và mô hình biểu hiện gen thu được từ một tập hợp các tế bào đó vì thế chỉ thể hiện trung bình chung của tất cả các tế bào có mặt. Kết quả như vậy nói cho chúng ta biết không nhiều về bất kỳ loại tế bào nào trong tập hợp; vấn đề tương tự cũng gặp phải khi đánh giá biểu hiện gen của một hỗn hợp tế bào liên quan đến các bệnh khác.

Tính không đồng nhất về tế bào cũng là một đặc trưng của sự phát triển cơ quan, trong đó các tế bào tiền thân chưa có sự khác biệt về mặt mô học cần trải qua các chọn lựa biệt háo khác nhau để trở thành các loại tế bào cụ thể. Phân tích biểu hiện gen của tập hợp các tế bào tiền thân không cho phép phân biệt các tín hiệu điều khiển lộ trình biệt hóa.

Thập kỷ trước đã chứng kiến những tiến bộ công nghệ mạnh mẽ, cho phép phân tích biểu hiện gen được thực hiện với độ chi tiết cao hơn trước đó. Thật vậy, mức độ biểu hiện của mỗi gen, kể cả là mỗi tế bào, giờ đây đã được xác định. Công nghệ này được gọi là giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq), giúp xác định nhanh mô hình biểu hiện gen chính xác của hàng chục ngàn tế bào riêng biệt. Phân tích theo cách như vậy – từng tế bà một – cung cấp cái nhìn ý nghĩa hơn nhiều về hành vi tế bào, so với phân tích cả khối thông tin kết hợp. Ví dụ, giải trình tự ARN đơn tế bào trên các tế bào khối u cho phép phân biệt các nguyên bào sợi ung thư với tế bào biểu mô và tế bào ung thư trên cơ sở các mô hình biểu hiện gen. Hơn nữa, mỗi loại tế bào còn được chia thành các ‘subtypes’. Nghiên cứu đơn tế bào còn giúp xác định các loại tế bào chưa từng được biết đến trước đó [1-3].

Cách mạng công nghệ này còn mang lại những hiểu biết giá trị về những cơ chế phát triển cơ quan và bệnh sinh. Việc phân tích mô lành, mô đang phát triển và mô bệnh giúp chúng ta biết rõ hơn làm thế nào một tế bào duy nhất, là hợp tử, lại phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh và làm thế các các con đường và quá trình phân tử bị đảo lộn sẽ dẫn đến bệnh.

Sơ lược về phương pháp học

Nguyên lý của giải trình tự ARN đơn tế bào

Giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq), giải trình tự gen, công nghệ giải trình tự, giải trình tự ARNGiải trình tự ARN – dù là một tế bào duy nhất hay một hỗn hợp các tế bào – là một phương pháp mạnh mẽ để phân tích mô hình hiểu hiện gen, nó có liên quan đến việc phiên mã ngược ARN thành ADNc, sau đó ADNc trả qua quá trình giải trình tự thông lượng cao. Các gen được biểu hiện mạnh trong một mẫu thì tạo ra nhiều ARN hơn, nhiều ADNc được tạo ra hơn và nhiều trình tự ADN được phát hiện hơn so với các gen khác biểu hiện yếu. Vì thế, giải trình tự ARN cung cấp một chỉ thị kỹ thuật số về biểu hiện gen, với số lượng trình tự ADN đọc được tương ứng với mức biểu hiện của một gen nhất định trong một mẫu.

Khái niệm về giải trình tự ARN đơn tế bào thì tương tự, ngoại trừ việc các tế bào riêng rẽ cần phải được phân lập và, vì nó vốn chứa một lượng ARN rất nhỏ, một quá trình khếch đại sẽ giúp tạo ra một lượng ADNc đủ lớn để giải trình tự (hình 1). Đáng chú ý là, các phương pháp giải trình tự ARN đơn tế bào hiện nay cho phép  xác định mức độ biểu hiện của tất cả các gen.

 

Giải trình tự ARN đơn tế bào thông lượng cao

Có một số phương pháp giải trình tự ARN đơn tế bào cho phép phân tích một số lượng lớn tế bào trong thơi gian ngắn (thông lượng cao – high throughput). Mở đầu là hệ thống Fluidigm C1 (Fluidigm C1 microfluidics) từ 2012 đã cách mạnh hóa việc giải trình tự ARN đơn tế bào, có thể giải mã dữ liệu biểu hiện của 96 tế bào trong một lần chạy, trong khoảng thời gian là 1 ngày. High-throughput [5] Fluidigm IFC chips, được giới thiệu 2015, có thể phân tích đến 800 tế bào cùng lúc. Sau khi ly giải tế bào, phiên mã ngược và khuếch đại trong các vi buồng (microchambers), thư viện ADNc được tạo ra rồi được gắn với một barcode đặc hiệu tế bào, điều này cho phép các mảnh ADN rời rạc sau khi giải trình tự có thể được ghép nối thành hồ sơ cho tế bào đó.

Phương pháp vi giọt (Microdroplet)

Các phương pháp giải trình tự ARN đơn tế bào phổ biến nhất hiện nay sử dụng các vi giọt đặc trong các vi buồng [4-6] (Hình 2). Việc sử dụng công nghệ microfluidics cho phép hàng trăm ngàn vi giọt có thể được tạo ra một cách không hề đắt đỏ. Các giọt này, được bao bọc bởi dầu, có thể tích cỡ 2 nanolit, chứa 1 tế bào và một hạt (bead) đính một tập hợp các oligonucleotide riêng biệt đã được mang barcode. Sau khi phá vỡ tế bào, các oligonucleotide gắn barcode lai với các đuôi polyA của mARN. Đối với Drop-seq, các hạt, cùng với oligonucletide và các mARN bắt cặp tương ứng, được giải phóng khỏi giọt lỏng và đưa vào một ống riêng, rồi phiên mã ngược được tiến hành. Với các công nghệ ChromiumInDro, các hạt hydrogel được hòa tan trong các vi giọt, giải phóng các oligonucleotide để lai với mARN, và phiên mã được được thực hiện trong giọt đó.

Giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq), giải trình tự gen, công nghệ giải trình tự, giải trình tự ARN, giải trình tự ARN dựa vào vi giọt

Trong cả hai cách, barcode đặc hiệu của hạt bead cũng được tích hợp vào ADNc, vì thế cho phép các trình tự ADNc được đọc sau đó vẫn được sắp xếp vào hồ sơ cho từng tế bào cụ thể. Tất cả các hệ thống dựa vào vi giọt cho phép các hạt bead [6] hoặc các ADNc [7, 8] được trộn lẫn và được xử lý cùng nhau thông qua các phản ứng, vì thế giảm thiểu thao tác và chi phí hóa chất.

Thực tế, sử dụng các phương pháp này, dữ liệu giải trình tự ARN, bao gồm cho phí giải trình tự ADN, có thể đạt được với chi phí xấp xỉ $1 mỗi tế bào. Một nghiên cứu so sánh các hệ thống Drop-seq, Fluidigm 800 cell IFC và Chromium chỉ ra khả năng giải trình tự tương đương [9], nhưng cả hai phương pháp dùng vi giọt có chi phí/tế bào thấp hơn đáng kể so với Fluidigm.

Còn khi so sánh hai phương pháp sử dụng vi giọt là Chromium và Drop-seq thì Chromium có ưu điểm hơn. Một là dữ liệu do Chromium trả có chất lượng cao hơn một chút, vì nó phát hiện nhiều gen/tế bào hơn so với phương pháp Drop-seq. Độ nhạy cao hơn, lại kết hợp với độ nhiễu được hạn chế, là đặc biệt quan trọng nếu muốn phân biệt các loại tế bào có họ hàng rất gần gũi, bởi các dữ liệu nhiễu có thể che đậy những khác biệt rất mơ hồ giữa các mô hình biểu hiện gen. Thứ hai, Chromium có khả năng phân tích tỉ lệ tế bào đưa vào cao hơn nhiều. Nghĩa là, với Chromium gần như mọi tế bào đều nhập vào vi giọt cùng với hạt bead, nhưng với Drop-seq thì một tỉ lệ lớn tế bào đi vào vi giọt mà không có hạt bead vào cùng, vì thế các tế bào đó không được giải trình tự. (Đó là bởi vì trong phương pháp Drop-seq, cả các hạt bead và tế bào được hợp vào các vi giọt theo kiểu ngẫu nhiên.) Nguy cơ đến với Drop-seq là hai tế bào với một hạt bead có thể vào cùng một giọt, mARN của cả hai tế bào sẽ có chung barcode và vì thế được quy cho là 1 tế bào. Một nguy cơ khác là hai hạt bead cùng đi vào một giọt, vì thế mARN của 1 tế bào lại được thể hiện bằng hai barcode, rốt cuộc một tế bào được đếm hai lần. Vậy nên hạt bead và tế bào cần phải được pha loãng một cách phù hợp để ngăn cản các giọt nhận 2 tế bào hoặc 2 hạt bead. Ngược lại, gần như tất cả các giọt được sinh ra bởi hệ thống Chromium đều chỉ có 1 hạt bead, vì hạt hydrogel lớn được dùng trong hệ thống có thể được nạp với nồng độ rất cao. Nhược điểm duy nhất của Chromium so với Drop-seq là giá hóa chất cao hơn nhiều.

Các phương pháp không dùng vi giọt

Ngoài cơ chế dựa vào vi giọt như kể trên, giải trình tự ARN đơn tế bào còn được thực hiện trong các đĩa chứa rất nhiều giếng cực nhỏ (microwell plates), giải trình tự ARN được thực hiện trên các tế bào, và tế bào được phân lập bằng FACS chẳng hạn. Nhiều phương pháp có thể dựa trên cơ sở các đĩa nhiều giếng này, như SMARTseq2 chemistry [10], Cel-seq [11], MARS-seq [12] và STRT-seq [13]. SMART-seq2STRT-seq dùng PCR để khuếch đại các sản phẩm ADNc của bước phiên mã ngược, còn Cel-seqMARS-seq tích hợp một promotor của thực khuẩn thể vào ADNc, sau đó được khuếch đại thông qua phiên mã in vitro.

Các phương pháp trên nền tảng này không bị giới hạn bởi kích cỡ tế bào như trong hệ thống Fluidigm vốn phải đòi hỏi các máy khác nhau cho từng kích cỡ tế bào. Dù rằng các phương pháp vi giọt khác bớt ‘đòi hỏi’ hơn Fluidigm về khoản kích cỡ tế bào, song các giọt rất lớn so với tế bào nên chúng có xu hướng bị tắc nghẽn khi tạo các giọt bao một số loại tế bào lớn như tế bào thần kinh, cơ. Ngoài ra, đòi hỏi về thiết bị và chi phí set-up dành cho phương pháp đĩa nhiều giếng.

Các phương pháp, như SMART-seq2, cho phép giải trình tự ADNc ở phổ toàn diện, tức là có thể phân tích các kiểu cắt nối thay đổi (alteARNtive splicing), vì thế xác định các bản phiên mã khác nhau (có thể) mang các chức năng khác nhau từ cùng một gen. Ngược lại, các phương pháp dựa vào vi giọt Drop-seq, InDrop, Chromium và 800 cell IFC Fluidigm chỉ có thể cung cấp thông tin trình tự theo chiều 3’ hoặc 5’ của ADNc và không phải toàn bộ bản phiên mã, và vì thế không thể dùng để phân tích các kiểu cắt nối thay đổi. Về giá thành, STRT-seq-2i (phiên bản 2017), dùng đĩa 9600 giếng có thể xác nhận từng tế bào và cho ra kết quả giải trình tự ARN chất lượng cao, với giá cạnh tranh chỉ $1/tế bào, đã tính cả giải trình tự ADN [14].

CytoSeq là một công nghệ giải trình tự ARN mạnh mẽ khác, trong đó từng tế bào riêng rẽ được đưa vào giếng nhờ trọng lực, trong khi một dung dịch huyền phù chứa các hạt bead bão hòa được phủ lên các giếng, nhờ thế mỗi giếng nhận một hạt bead. Các hạt bead cũng mang các oligonucleotide gắn barcode đặc trưng cho bead, và kích thước hạt cho phép mỗi giếng chỉ chứa một hạt. Các hạt bead thừa sau đó được rửa đi, tế bào được ly giải, mARN từ mỗi tế bào thì lai với các oligonucleotide trên hạt bead, giống như trong Chromium và Drop-seq. Ưu điểm của nó là hệ thống máy đơn giản, dễ dàng nhân rộng bàng việc tăng số giếng trên đĩa.

Tuy nhiên một công nghệ khác nữa, là SPLiT-seq, thậm chí còn giảm thiểu hơn nữa yêu cầu về thiết bị, có thể giảm chi phí chỉ còn $0.01/tế bào hoặc thấp hơn [15].

Thách thức đối với các nghiên cứu đơn tế bào

Giới hạn về vật liệu nghiên cứu

Thách thức cơ bản của nghiên cứu đơn tế bào là lượng vật liệu nghiên cứu rất hạn chế. Mỗi tế bào trung bình chỉ chứa khoảng 10 pg ARN tổng số, trong đó khoảng 0.1 pg là mARN [16]. Đối với nhiều gen, chỉ có khoảng 10 bản sao phiên mã trên mỗi tế bào. Vì thế tất cả các công nghệ kể trên đều cần bước khuếch đại ADNc hiệu quả để giải trình tự được lượng ARN đơn tế bào.

Khó khăn tiếp tục, khi khuếch đại tạo ADNc không bao giờ tuyến tính hoàn toàn, dẫn đến thể hiện sai lệch tỉ lệ của tất cả ADNc trong mỗi tế bào. Để vượt qua được, gần như tất cả các công nghệ hiện nay đều tích hợp một mã phân tử đặc trưng (UMI) vào mồi dùng trong bước phiên mã ngược. Ví dụ trong hệ thống Drop-seq, các oligonucleotide của mỗi hạt bead đều chứa cùng một barcode 12 base, để các trình tự ADN sau khi giải mã có thể quy về một tế bào dựa vào barcode này. Bên cạnh đó, mỗi oligonucleotide trên từng hạt bead còn mang thêm một UMI barcode dài 8 base hoàn toàn khác nhau để phân biệt các oligonucleotide; sự có mặt của UMI barcode này có ý nghĩa là tất cả các mảnh ADN được giải mã mang cùng một UMI barcode có thể quy về một mARN và một oligonuleotide tương ứng. Việc đếm số sản phẩm ADNc sau phiên mã ngược thay vì đếm số bản sao ADN sau khi PCR giúp tránh sai lệch trong việc phân tích biểu hiện gen.

Giữ được từng tế bào riêng rẽ

Một thách thức khác của giải trình tự ARN đơn tế bào là quá trình phá hủy một mô thành các tế bào để phân tích. Một phương pháp đó là vi thao tác đơn giản [17], ví dụ sử dụng một micropipet và một kính hiển vi, để tách riêng từng tế bào từ các lát cắt mô học hoặc một phôi sớm. Phương pháp này đảm bảo từng tế bào được tách riêng, nhưng tốn nhiều công sức và năng suất thấp. Vi phẫu bằng laze (LCM) cũng có thể áp dụng, bằng một chùm tia laze để tách các tế bào từ các lát cắt đông lạnh [18, 19]. Một ưu điểm của nó là có thể cho biết thông tin về vị trí của tế bào quan tâm, nhưng cũng có nhược điểm tương tự như trên.

Nếu loại tế bào quan tâm rất ít, thì FACS có thể dùng để làm giàu. FACS có thông lượng cao và có thể còn được dùng để đưa từng tế bào vào đĩa 96 giếng, vốn là một bước quan trọng cho một số phương pháp giải trình tự ARN đơn tế bào.

Một phương pháp khác dựa vào bản chất thông lượng cao của các công nghệ giải trình tự ARN hiện nay, bằng cách giải trình tự một cách đồng thơi số lượng các tế bào – có thể đến hàng triệu – tách rời ra từ mô. Theo kiểu này, mỗi loại tế bào trong mô được phân tích, trừ khi nó tồn tại quá ít. Phương pháp này cũng không dùng marker và không cần các nhãn đặc hiệu tế bào (như GFP trong trương hợp chọn tế bào bằng FACS)  và có thể được áp dụng với hầu hết các mô. Dù thế, tất cả thông tin về không gian (vị trí) cũng mất theo khi tế bào tan rã khỏi mô chính là một thách thức. Tái tạo một bản đồ biểu hiện gen ba chiều ở cấp độ từng tế bào dựa vào phương pháp này vì thế đòi hỏi một bước nữa trong đó tất cả các loại tế bào được định bị không gian nhờ tin sinh học dựa trên cơ sở là hiểu biết về các dấu ấn biểu hiện gen của chúng. Các phân tích như vậy có thể tạo ra một cơ quan ảo, với tất cả các nhân tố phiên mã, nhân tố tăng trưởng và các protein tiết hay các thụ thể được xác định hoàn toàn cho từng loại tế bào (Hình 3). Chiến lược này đã đang được dùng để tạo ra một phôi ảo phản ánh các gen biểu hiện trong quá trình phát triển ấu trùng ruồi giấm, mang lại một công cụ thực sự mạnh mẽ cho cộng đồng nghiên cứu [20].

Giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq), giải trình tự gen, công nghệ giải trình tự, giải trình tự ARN

Một khó khăn đối với phương pháp nói trên là các enzyme thường được dùng cho bước làm tan rã mô, bao gồm trypsin, collagenase, TrypLE, dispase, liberase và pronase đều hoạt động ở 37oC. Đây cũng là nhiệt độ tối thích của các enzyme tồn tại trong các tế bào thú, bao gồm các enzyme thuộc bộ máy phiên mã. Chúng ta có thể suy ra rằng các tế bào sẽ thay đổi mô hình biểu hiện gen của chúng để đáp ứng với môi trường ngoài trong quá trình chúng ta đang phân tách tế bào. Vì thế, ngộ nhận mức độ biểu hiện gen trong quá trình phân tách tế bào gần như chắc chắn, chỉ là ở mức độ nào đó, làm sai lệch phần lớn các bộ dữ liệu scRNA-seq mà chúng ta có cho đến nay.

Một cách để hạn chế tối đa ngộ nhận trên là thực hiện giải trình tự ARN trong nhân, thay vì cả tế bào. Nhược điểm chính của cách làm này là chỉ có một lượng ARN rất nhỏ (10 – 20%) là có trong nhân, vì thế độ nhiễu kỹ thuật càng tăng lên. Các phân tích ARN nhân cũng sẽ bao gồm một tỉ lệ lớn hơn các bản phiên mã chưa được chế biến, nên chúng vẫn chứa intron, điều này làm phức tạp hóa việc phân tích. Ngoài ra, có một số quan ngại rằng mức độ nào thì ARN nhân có thể phản ánh chính xác hàm lượng ARN trong tế bào chất. Dù đó vẫn là những thách thức, phương pháp này có nhiều tiềm năng trở thành một công cụ mạnh cho phân tích biểu hiện gen tế bào trong trường hợp quá trình phân tách tế bào riêng rẽ hay phân tích ARN tế bào chất gặp phải vấn đề.

Nhiễu

Một hạn chế lớn khác chính là hệ quả của sự nhiễu, sinh ra từ bản chất biến động của biểu hiện gen [21-23]. Các gen không biểu hiện theo kiểu cố định mà luôn hoạt động phiên mã theo kiểu rời rạc với những thời điểm bùng nổ ngắn, nghĩa rằng với một tế bào, mức độ phiên mã của nhiều gen là biến đổi không ngừng. Một hạn chế thứ hai xuất phát từ mặt phương pháp học, khi mà đo lường mức độ phiên mã và bắt đầu với lượng ARN có rất ít trong tế bào. Các ước tính hiện nay gợi ý rằng đa số các công nghệ giải trình tự ARN đơn tế bào chỉ phát hiện khoảng 10 – 20% số phân tử mARN thực sự có mặt [13, 24]. Độ nhạy kém như vậy vì thế cần phải cải thiện. Đặc biệt là mức độ biểu hiện gen thấp thì càng khó phát hiện; phiên mã ngược và khuếch đại không hiệu quả vì thế lại bổ sung thêm một lớp nhiễu đáng kể nữa vào các nghiên cứu này. Hai mươi phần trăm nhiễu trong các nghiên cứu giải trình tự ARN đơn tế bào được ước tính là bắt nguồn từ bản chất sinh học, tỏng khi 80% còn lại được cho là vì các hạn chế về mặt kỹ thuật [25].

Khái quát một vài ứng dụng của giải trình tự ARN đơn tế bào

Xác định mô hình biểu hiện gen của từng tế bào đang nhanh chóng trở thành một công cụ phân tích tiêu chuẩn cho các nhà nghiên cứu ở nhiều chuyên ngành, bao gồm giải phẫu thần kinh học, miễn dịch học và tim mạch, v.v…

Trong sinh học phát triển

scRNA-seq là một công cụ rất mạnh để nghiên cứu về sinh học phát triển. Thời kỳ đầu trong sự phát triển cơ quan, tập hợp các tế bào thường trông giống nhau về mặt mô học nhưng sẽ biệt hóa theo các hướng khác nhau để hình thành các loại tế bào riêng biệt. Hiểu rõ hơn về các mô hình biểu hiện gen đã thúc đẩy những con đường biệt hóa khác nhau sẽ cải thiện hiểu biết của chúng ta quá trình phát triển cơ quan. Phân tích biểu hiện của cả tập hợp các tế bào là không phù hợp trong trường hợp này, vì phân tích có thể gộp hết các tế bào mà rốt cuộc chúng sẽ biệt hóa theo các con đường khác biệt. Nghiên cứu đơn tế bào khi đó có thể xác định các mô hình biểu hiện gen liên quan đến định hướng phát triển của các tế bào gần kề.

Trong ung thư

Như đã nhắc ở phần đầu, khối u chứa một hỗn hợp không đồng nhất các tế bào bao gồm các loại tế bào ung thư, mạch, miễn dịch và nguyên bào sợi. Mỗi loại trong số đó có thể còn chia thành các subtype. Một loại khác nữa là các tế bào nền, đóng góp vào vi môi trường khối u và thúc đẩy các tế bào tăng sinh thông quan tín hiệu cận tiết. Nghiên cứu mô hình biểu hiện gen của các tế bào nền trong vi môi trường khối u cũng cung cấp giá trị tiên lượng khác biệt với giá trị tiên lượng thu được từ việc nghiên cứu trực tiếp các tế bào trong khối u [26, 27]. Rõ ràng công nghệ giải trình tự ARN đơn tế bào là một công cụ hữu dịch để giải phẫu đặc điểm của nhiều loại tế bào bên trong và bao quanh khối u.

Một nghiên cứu tiên phong sử dụng công nghệ này để xác định tính không đồng nhất tế bào trong ung thư biểu mô thận tế bào trong suốt [28] với mục đích xác định các con đường tín hiệu hoạt động, có thể giúp định hướng các chiến lược điều trị.  Các nhà nghiên cứu đã phân tích một số lượng hữu hạn tế bào ung thư từ một bệnh nhân, bao gồm (1) 34 tế bào di căn, (2) 36 tế bào từ mô cấy ghép lên cá thể khác (nguồn cấy ghép từ di căn của bệnh nhân) và (3) 46 tế bào từ mô cấy ghép lên cá thể khác (nguồn cấy ghép từ tế bào khối u nguyên phát của bệnh nhân). Các chiến lược thuốc nhắm đích đã hoạt động trên (2) và (3) và điều đó phản ánh độ nhạy với thuốc là khác nhau. Các tế bào doc ăn cho thấy độ nhạy cảm với các thuốc nhắm đến thụ thể của EGF (gefitinib, erlotinib và afatinib), họ kinase SRC (dasatinib) và BRAF–MEK (selumetinib), trong khi đó các tế bào khối u nguyên phát nhạy cảm hơn với các thuốc tấn công MET kinase
(tivantinib, foretinib và crizotinib) và phosphoinositide 3-kinase (BKM120). Phân tích chi tiết tính không đồng nhất tế bào trong khối u nguyên phát và di căn gợi ý rằng điều trị cả afatinib và dasatinib có thể có hiệu quả hơn; thật vậy sự kết hợp điều trị này có tác động hợp lực lên các mô ghép ngoại lai di căn. Nghiên cứu giải trình tự ARN đơn tế bào vì thế có thể được dùng để thiết kế các phương pháp trị liệu tối ưu cho từng bệnh nhân.

Lời kết

Khác với các nghiên cứu biểu hiện gen sử dụng các mẫu ARN cộng gộp lượng lớn và cung cấp thông tin chung chung cho một tập hợp các tế bào khác nhau, nghiên cứu đơn tế bào chỉ ra khác biệt về phân tử của tất cả các loại tế bào trong một hỗn hợp phức tạp, như là trong khối u hay trong cơ quan đang phát triển. Hơn thế, nghiên cứu biểu hiện đơn tế bào còn cho phép xác định đặc tính của các loại tế bào đã biết trước đó một cách đầy đủ hơn và thúc đẩy việc xác định các nhóm tế bào mới, đóng góp vào cải thiện hiểu biết của chúng ta về các quá trình sinh lý bình thường hoặc bệnh sinh, và dẫn đến các phương pháp điều trị mới. Mặc dù các hạn chế vẫn còn đó, công nghệ phân tích mô hình biểu hiện gen của từng tế bào đang cải thiện nhanh chóng và bắt đầu tạo nên một bản đồ chi tiết về mô hình biểu hiện gen của tất cả các loại tế bào trong cơ thể người.

Trích dẫn tham khảo

1. Tang, Q. et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using ARN sequencing. Exp. Med. 214, 2875–2887 (2017).

2. Baron, M. et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Syst. 3, 346–360. e4 (2016).

3. Villani, A. C. et al. Single-cell ARN-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science 356, eaah4573 (2017).

4. Regev, A. et al. The Human Cell Atlas. eLife 6, e27041 (2017).

5. DeLaughter, D. M. et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Cell 39, 480–490 (2016).

6. Macosko, E. Z. et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell 161 , 1202–1214 (2015).

7. Zheng, G. X. et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Commun. 8, 14049 (2017).

8. Klein, A. M. et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell 161 , 1187–1201 (2015).

9 . Magella, B. et al. Cross-platform single cell analysis of kidney development shows stromal cells express Gdnf. Dev. Biol. 434, 36–47 (2018).

10. Picelli, S. et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Methods 10, 1096–1098 (2013).

11. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N. & Yanai, I. CEL-Seq: single-cell ARN-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Rep. 2, 666–673 (2012).

12. Jaitin, D. A. et al. Massively parallel single-cell ARN-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science 343, 776–779 (2014).

13. Islam, S. et al. Quantitative single-cell ARN-seq with unique molecular identifiers. Methods 11 , 163–166 (2014).

14. Hochgerner, H. et al. STRT-seq-2i: dual-index 5’ single cell and nucleus ARN-seq on an addressable microwell array. Rep. 7, 16327 (2017).

15. Rosenberg, A. B. et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science 360, 176–182 (2018).

16. Wang, Y. & Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Cell 58, 598–609 (2015).

17. Xue, Z. et al. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell ARN sequencing. Nature 500, 593–597 (2013).

18. Kamme, F. et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. Neurosci. 23, 3607–3615 (2003).

19. Frumkin, D. et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC Biotechnol. 8, 17 (2008).

20. Karaiskos, N. et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science 358, 194–199 (2017).

21. Ross, I. L., Browne, C. M. & Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177–185 (1994).

22. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D. & van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Genet. 31 , 69–73 (2002).

23. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A. & Tyagi, S. Imaging individual mARN molecules using multiple singly labeled probes. Methods 5, 877–879 (2008).

24. Svensson, V. et al. Power analysis of single-cell ARN-sequencing experiments. Methods 14, 381–387 (2017).

25. Kim, J. K., Kolodziejczyk, A. A., Ilicic, T., Teichmann, S. A. & Marioni, J. C. Characterizing noise structure in single-cell ARN-seq distinguishes genuine from technical stochastic allelic expression. Commun. 6, 8687 (2015).

26. Finak, G. et al. Stromal gene expression predicts clinical outcome in breast cancer. Med. 14, 518–527 (2008).

27. Galon, J. et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960–1964 (2006).

28. Kim, K. T. et al. Application of single-cell ARN sequencing in optimizing a combinatorial therapeutic strategy in metastatic renal cell carcinoma. Genome Biol. 17, 80 (2016).

Bài viết được tham khảo từ Springer Nature

iceberg (biên tập)

tapchisinhhoc.com

Xem thêm: Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Phát hiện tế bào thần kinh mới chỉ có trong não người giờ giải trình tự ARN đơn tế bào

Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới trong khoa học hình sự

Các bệnh Chăm Sóc Răng Miệng Dinh dưỡng Sống khỏe Sức Khỏe Giới Tính Sức Khỏe Nam Giới Sức Khỏe Phụ Nữ
Samonella
Tổng quan về vi khuẩn Salmonella
Bacillus cereus
Bacillus cereus: Vi khuẩn gây ra ‘Hội chứng cơm chiên’
Mỡ và ung thư liên quan như thế nào?
Hỏi Đáp Hướng dẫn Kinh nghiệm Sáng tạo
Quy định về Thực hành tốt sản xuất thuốc và nguyên liệu làm thuốc
Ba điều ngộ nhận về giá trị p (p-value) trong thống kê sinh học
So sánh trình tự – BLAST online
Kỹ thuật mới Phát minh khoa học Vật liệu mới
Công cụ chỉnh sửa gen mới có thể vượt trội CRISPR
10 hướng tiềm năng của công nghệ sinh học nông nghiệp
Giải trình tự ARN đơn tế bào (scRNA-seq)
Dược phẩm Giải thưởng Nobel Giáo dục Nông nghiệp Sự kiện tiêu biểu Thủy sản Y học
Nobel Y Sinh 2019 cho những phát hiện về cách tế bào cảm nhận và đáp ứng với nồng độ oxy
Các quy trình tách dòng không sử dụng các enzyme giới hạn hoặc ligase
Đột biến gen thứ hai liên quan đến tính kháng HIV